miR-1202通過調控小鼠腦內的mGluR4的表達在重度抑郁癥中的作用*

西安市中心醫院神經內科(西安 710003)

雷　輝　 顧乃兵　劉志勤　常明則

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miR-1202通過調控小鼠腦內的mGluR4的表達在重度抑郁癥中的作用*

西安市中心醫院神經內科(西安 710003)

雷輝 顧乃兵劉志勤常明則

目的：探討miR-1202在重度抑郁癥中的作用及機制。方法：使用過表達miR-1202的腺相關病毒和慢性不可預見性應激模型的小鼠，通過曠場實驗和強迫游泳實驗等行為學實驗來評估miR-1202的作用；通過Western-Blot實驗來驗證miR-1202的分子機制。結果：在抑郁癥模型小鼠海馬區域中過表達miR-1202發現抑郁癥癥狀有所緩解，WB檢測實驗驗證miR-1202的靶基因為mGluR4。結論：在小鼠海馬區域中的miR-1202通過mGluR4參與了重度抑郁癥，這為未來治療抑郁癥提供了一個新的靶點。

長期以來，抑郁癥一直是精神障礙疾病中最常見且棘手的問題，也是神經科學和心理學界研究的熱點。據專家預測:到2030年，除心血管疾病以外，抑郁癥將成為人類健康的主要殺手[1]。

本研究通過在動物水平談討如何通過調控miR-1202來治療抑郁癥，并進一步尋找miR-1202的下游靶基因以分析其在抑郁癥中的分子機制，為未來治療抑郁癥找到一個新的靶標[2]。

材料與方法

1 實驗動物 C57BL/6小鼠32只，購買自上海中科院生命科學研究院下屬斯萊克公司，所有動物均經檢疫合格，所有動物實驗均經過動物倫理認證。

2慢性不可預見性應急模型制作每組小鼠8只。接受連續6～8周各種不同的應激，每天隨機給予一種刺激，每種刺激出現2～3次，同一種刺激不能連續出現，使動物不可預知給予的刺激，應激方案如下：高速水平震蕩(120次/min，持續時間第1周，45 min；第2周，60 min；第3周，90 min)；強迫游泳(5 min；水溫，第1周，10℃；第2、3周，8℃)；制動(持續時問第1周，45 min；第2周，60 min；第3周，90 min)；夾尾(距尾根1 cm，1 min)；禁水24 h；禁食24 h；熱刺激6 min(45℃烘箱)；鼠籠45°傾斜24 h。為減少不同應激對行為和生化指標的影響，測試當天所有小鼠都接受相同刺激，并在進行行為學檢測實驗之前的1h之內，確保小鼠正在接受刺激。

3miR1202制備及給藥我們使用的AAV病毒是適合于中樞神經系統的AAV2/9血清型的AAV病毒，具體我們包裝了pAAV(2/9)-CAG-mcherry-miR1202，PAAV(2/9)-CAG- mcherry -miR NC對照兩種AAV病毒，滴度均純化濃縮到1×1012v.g./ml，每只C57動物腦立體定位后單側海馬注射0.2μl，抑郁癥組注射等體積的生理鹽水。

4曠場實驗在直徑為1.5m×1.5m的黑暗曠場上方放置攝像頭，監視動物在曠場內的活動情況，采集視頻后由軟件計算分析各項行為指標。具體為將小鼠放在曠場中觀察，給予10s的適應期后，開始記錄小鼠行為10min，分析小鼠在中央停留時間和水平活動總距離。

5強迫游泳實驗實驗分為兩天進行，第1天將單只小鼠放入水中讓其游15min，使其適應，然后取出用干布擦干，歸籠。第2天再次將小鼠放入缸中游泳15min，分析儀自動記錄10min內累加的不動時間，作為小鼠強迫游泳的指標。

6取材及mGluR4蛋白含量分析小鼠用CO2窒息后，主動脈灌流并快速分離腦組織。在0.3 mol/L PBS(pH=7.2)中制取勻漿，4℃ 放置1.5 h后，12 000 r/min離心15 min，取上清液12 000r/min離心15 min。再取上清液并按Spector的方法測定蛋白濃度，置-27℃保存。蛋白經SDS-10% 聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離，將蛋白轉移至硝酸纖維膜(Schleicher &Schuell公司)，用麗春紅將硝酸纖維膜染色并照相。剪下標準蛋白的泳道，經5% 脫脂奶粉封閉，同時加入兔抗鼠mGluR4抗體(1∶200稀釋，Santa Cruz公司)和作為內參照的GAPDH抗體(1∶2000稀釋，Santa Cruz公司)，置4℃冰箱過夜。二抗為辣根過氧化物酶(HRP)標記的驢抗兔IgG(1∶1000 稀釋，Kangchen 公司)。用DAB-H2O2顯色。將曝光的X光膠片用掃描儀掃描為圖像文件，用Quantity One軟件測定每個特異性條帶的光密度×面積，以GAPDH為內參照，計算mGluR4值/GAPDH值。

結　果

1AAV病毒注射的熒光圖片我們使用AAV2/9血清型的病毒經腦立體定位注射到正常的C57小鼠的海馬區域，冰凍切片得到熒光圖片見附圖。

附圖　 AAV(2/9)病毒注射到C57小鼠海馬區域的熒光圖片[左:立體定向儀固定大鼠，將AAV/(2/9)病毒定向注射至小鼠海馬區域;中:熒光顯微鏡下觀察到AAV病毒的表達(紅色);右:Hoechst染色(藍色)證實AAV病毒在C57小鼠海馬齒狀回表達]

2行為學實驗結果我們將生理鹽水及PAAV(2/9)-CAG- mcherry -miR NC對照和pAAV(2/9)-CAG-mcherry-miR1202兩種AAV病毒，分別經腦立體定位注射到慢性不可預見性應激模型的C57小鼠的海馬區域內，行為學發現注射過表達miR1202的AAV病毒的C57小鼠，曠場實驗中在10min內的休息時間顯著少于抑郁癥組和對照組但比正常小鼠組休息時間長；強迫游泳實驗中在10min內的絕對不動時間顯著少于抑郁癥組和對照組，但比正常小鼠絕對不動時間長(P<0.01)。

3Western Blot法檢測各組小鼠的海馬組織中的mGluR4蛋白的表達我們使用Western Blot法在正常C57小鼠，抑郁癥小鼠和過表達miR1202的AAV病毒組的抑郁癥小鼠的海馬組織中檢測mGluR4蛋白的表達水平的差異變化。發現抑郁癥小鼠的海馬組織中mGluR4蛋白相對表達水平顯著的高于正常C57小鼠，而經過注射過表達miR1202的AAV病毒的抑郁癥小鼠的海馬組織中的mGluR4蛋白相對表達水平顯著下調(P<0.01)。

討　論

2014年，加拿大的麥吉爾大學和道格拉斯精神衛生研究所的德瑞奇教授，通過對加拿大道格拉斯貝爾大腦庫中重度抑郁癥病人的腦和血樣本的分析，發現了一種只有在人類和靈長類動物大腦中才存在的新的micro RNA分子: miR-1202[3]。

MicroRNA(miRNA)是一種人類中內源表達的、總長度大約為20～24個核苷酸的小RNA分子。現在發現miRNA分子是在細胞內具有多種重要的調節作用，對基因表達具有重要的調控作用。每個miRNA一般對應多個的靶基因，而且往往幾個miRNA可以同時調控同一個靶基因，所以這種復雜的調控網絡是既可以通過一個miRNA來調控多個基因的表達，也可以通過幾個miRNA的組合來精細調控某一個基因的表達。這樣就構建了一個復雜的、相互交織的基因表達調控網絡。大部分miRNA基因在染色體上的位置在不同的物種中是高度保守的，而且序列上也呈現出高度的同源性。miRNA高度的保守性與其功能的重要性有著密切的關系。嚴重的抑郁癥患者會出現不同程度的學習和記憶功能障礙，其主要原因是長期慢性或急性壓力所導致的患者腦內海馬的萎縮。有觀點認為在抑郁癥患者腦內的關鍵區域會發生神經元可塑性的改變。隨著對 miRNA 研究的深入，人們發現 miRNA 也參與到抑郁癥的病理生理過程中，可以從多個方面影響抑郁癥[4,5]。miRNA 表達或功能失調可能在抑郁癥的發生中發揮重要作用[6,7]。

谷氨酸作為中樞神經系統中重要的興奮性神經遞質之一在大腦中涉及到學習、記憶、焦慮以及疼痛的感知[8,9]。谷氨酸受體可以分為離子型谷氨酸受體和代謝型谷氨酸受體，它們在腦的海馬體、小腦、大腦皮質等其他組織及周圍組織，神經突觸的突觸前和突觸后神經元都有發現。代謝型谷氨酸受體是G蛋白偶聯受體家族， mGluR4并沒有離子通道的作用，而是通過生化級聯反應來使其它蛋白(如離子通道)變構，從而改變突觸的興奮性[10,11]。比如神經傳遞的突觸前抑制，和突觸后反應的調節甚至誘導。本研究發現：miR-1202的靶基因就是mGluR4，那miR-1202有可能是通過調控mGluR4從而影響了海馬神經元的突觸的興奮性，從而引起了抑郁癥狀的改變。

本研究在動物水平通過慢性不可預見性應激模型的小鼠的海馬中精確調控miR-1202的表達，行為學在過表達miR-1202時會緩解抑郁癥。這些結果充分驗證加拿大德瑞奇教授的臨床數據，確認了miR-1202在抑郁癥中發揮了重要作用[12]，這個實驗也為未來治療抑郁癥找到一個新的靶標。

[1] Kendler KS，Aggen SH，Li Y,etal. The similarity of the structure of DSM-IV criteria for major depression in depressed women from China, the United States and Europe[J]. Psychol Med， 2015,17(3):1-10.

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[4]Saus E,Soria V,Escaramis G,etal. Genetic variants and abnormal processing of pre-miR-182, a circadian clock modulator, in major depression patients with late insomnia[J].Hum Mol Genet,2010,19(20):4017-4025.

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(收稿：2015-03-20)

Effect of miR-1202 on severe depression by regulating mGluR4expression in brain of mice

Department of Neurological Disease，Xi’an Central Hospital(Xi’an 710003)

Lei HuiGu NaibingLiu Zhiqinet al

Objective:To investigate the the effect of over expression of miR-1202 on severe depression. Methods:We evaluated the role of miR-1202 in the open field test and forced swimming test and other behavioral experiments in chronic unpredictable stress model mice and we also used Western Blot to verify the molecular mechanism of miR-1202.Results:Over expression of miR-1202 was found to relieve depressive symptoms in mouse, the expression of mGluR4 decreased miR-1202 expressed in mouse. Conclusion:In hippocampus of mice , miR-1202 relieve depression symptom by decreasing the expression of mGluR4, which provides a new target for future therapy for the treatment of depression.

Depression/therapyDepression/physiopathologyHippocampusGenes/therapeutic useModel,animalsMice@miR-1202@mGluR4

R749.4

Adoi：10.3969/j.issn.1000-7377.2015.09.002

*陜西省自然科學基礎研究計劃項目(2014JM4162)

陜西省科技發展計劃資助項目(2014K110203)

主題詞抑郁癥/治療抑郁癥/病理生理學海馬基因/治療應用模型，動物小鼠@miR-1202@mGluR4