右美托咪啶對脂多糖致傷大鼠腎小管上皮細胞TLR4表達的影響*

西安市第四醫院麻醉科 (西安 710004)　雷安鋒　段　晶　陳　燕　彭春曉　王秋月

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右美托咪啶對脂多糖致傷大鼠腎小管上皮細胞TLR4表達的影響*

西安市第四醫院麻醉科 (西安 710004)雷安鋒段晶陳燕彭春曉王秋月▲

目的：觀察右美托咪啶對脂多糖致傷大鼠腎小管上皮細胞TLR4表達影響，探討其可能機制。方法: 將大鼠腎小管上皮細胞復蘇后培養，加入10ng/ml脂多糖(LPS)，均經培養后分為3組，A組為空白對照組，B組為對照組，加入右美托咪定2.5μg，C組為實驗組，先加入阿替美唑10μg后30min加入右美托咪定2.5μg，培養12h，免疫組化法檢測TLR4蛋白表達及TLR4mRNA水平，并測定細胞凋亡率。結果：B組應用右美托咪定后，TLR4水平為(45.1±13.5)×103均低于A組、B組(tBA=6.549，tBC=5.660，P<0.05)；B組TLR4mRNA相對表達值為0.46±0.02，均低于A組、C組(tBA=27.599,tBC=24.749,P<0.05)。B組使用右美托咪定后，細胞凋亡率為(34.6±7.6)%，均明顯低于A組、C組(P<0.05)。結論:右美托咪啶可下調脂多糖致傷大鼠腎小管上皮細胞TLR4表達，且右美托咪啶對TLR4的調節與α2AR被激動相關。

KEY WORDSKidney diseases/chemicalinducedLipopolysaccharidesDexmedetomidine/therapeutic useEpithelial cells/metabolismAnimals,laboratoryRats@TLR4

資料與方法

1主要試劑大鼠腎小管上皮細胞(XX細胞庫)；脂多糖(LPS 批號：L2880，天津灝洋生物制品有限公司)；右美托咪定(批號:09081232江蘇恒瑞醫藥股份有限公司)；ELISA試劑盒(北京科美東雅生物技術有限公司)；PTPCR試劑(大連寶生物工程有限公司)；引物合成(傷害生工生物工程技術服務有限公司)；PCR擴增儀(美國PE公司)

2研究方法復蘇細胞后，接種于50ml玻璃瓶中，于MEM培養基中行常規培養，MEM培養基含10%胎牛血清、100U/ml青霉+100U/ ml鏈霉素等，置入37°C、5%CO2飽和濕度的恒溫培養箱，并于每1～2h更換培養基；待細胞長成致密單層后，使用0.25%胰蛋白酶消化，按1×105濃度接種于24孔板中，使細胞貼壁生長18～24h。然后加入LPS(10ng/ml)培養12h。然后隨機分為3組，每組10個。

2.1處理方法：A組空白對照組。B組對照組，加入右美托咪定2.5μg，C組實驗組，先加入阿替美唑10μg后30min加入右美托咪定2.5μg。3組均繼續培養12h。

2.2TLR4水平及TLR4mRNA水平測定 ：①采取免疫組化方式測定腎臟組織TLR4水平。②測定TLR4mRNA水平：嚴格按照試劑說明進行，TLR4上游引物：5’-GTCCATCGGTTGATCTTGGGA-3’，下游引物為：5’-AGAATTGCCAGCCATTTTTAA-3’,擴增片段長度為681bp。β-action為內參，其上游引物為：5’-ACCACAGCTGAGAGGGAAATCG-3’,下游引物為：5’-AGAGGTCTTTACGGATGTCAAACC-3’,擴增片段長度為281bp。PCR反應體系反應條件：94℃環境下變性5min，然后按照94℃30s、51℃40s、72℃60s，行擴增30個循環，最后于72℃下延伸5min。最后取各組樣本產物5μl，與溴酚藍載樣緩沖液1μl一起加入1.5%瓊脂糖凝聚樣品孔中，70V恒壓電泳20min，使用DH2000凝膠圖像分析系統進行分析，TLR4mRNA灰度值與β-action灰度值比值作為TLR4mRNA表達水平。

2.3細胞凋亡檢測：使用PBS洗滌細胞，吸取含細胞平衡液100μl至離心管，加入5μl Annexin V-FITC及5μl PI,避光室溫反應15min，加入400μl平衡液于流式細胞儀上檢測。

3觀察指標①腎臟組織TLR4水平差異；②TLR4mRNA水平；③細胞凋亡率。

結　果

1三組大鼠腎臟組織TLR4水平及TLR4mRNA水平比較見表1。B組應用右美托咪定后，TLR4水平及TLR4mRNA為(45.1±13.5)×103、(0.46±0.02)均低于A組、C組(P<0.05)。

2三組大鼠腎臟組織細胞凋亡率比較見表2。

表1　 三組大鼠腎臟組織TLR4RTLR4 mRNA水平比較

表2　 三組大鼠腎臟組織細胞凋亡率比較(%)

B組使用右美托咪定后，細胞凋亡率為(34.6±7.6)%，均明顯低于A組、C組(P<0.05)。

討　論

研究[1]表明：急性腎損傷(AKI)為膿毒血癥并發癥之一，是各種原因所致機體腎功能在幾小時至幾天內突然下降的綜合征。研究[2]表明：約50%膿毒癥患者發生AKI，死亡率高達60%。

右美托咪啶(Dexmedetomidine,Dex)為新型高選擇性α腎上腺素能受體(α2adrenogic recptor,α2AR)激動劑，其機制為通過激動中樞神經系統α2A最密集的區域-腦干藍斑引發并維持自然非動眼睡眠狀態，產生鎮靜、催眠作用。Dex還具有鎮痛、穩定血流動力學和利尿的效應，可用于ICU患者的鎮痛，而且有研究[3]表明：Dex對膿毒癥大鼠的腎功能具有一定的保護作用,減少腎衰竭的發生。動物實驗[4]表明：膿毒癥大鼠體內LPS與腎臟TLR4結合，激活TLR4信號傳導通路，導致IκB從IκB/ NF-κB復合物釋放，NF-κB活化轉位進核，使信號下游致炎因子TNF-α，IL-1B和IL-6增多導致急性腎損傷。Dex降低膿毒癥大鼠血清TNF-α，IL-1B和IL-6。所以防治膿毒癥導致的急性腎損傷可以通過下調TLR4的表達或抑制TLR4信號通路控制炎性反應對腎臟損傷。而Dex可降低膿毒癥大鼠腎小管上皮細胞TLR4表達，達到腎臟保護作用。本研究結果表明：腎小管上皮細胞TLR4表達水平明顯低于A組，可見右美托咪定可下調腎小管上皮細胞TLR4表達，保護腎臟；而C組應用α2AR受體阻滯劑再應用右美托咪定，結果發現改組TLR4表達、TLR4mRNA及細胞凋亡均低于B組，可見右美托咪定下調TLR4表達發揮腎臟保護作用與α2AR受體激動有關。

[1]蔡玥嬌,劉華躍,鐘麗敏.右美托咪定對膿毒癥大鼠腦組織炎性反應的影響[J].中華麻醉學雜志,2013,33(6):749-751.

[2]何許偉,邱澤亮,樓天正.間歇性高容量血液濾過對嚴重膿毒癥患者Toll樣受體4的影響[J].中國醫師雜志,2013,7(1):58-60.

[3]Kumpf O，Giamarellos-Bourboulis EJ，Koch A，etal. Influenceof genetic variations in TLR4 and TIRAP/Mal on the course ofsepsis and pneumonia and cytokine release:an observationalstudy in three cohorts[J].Crit Care,2010，14(3):103-113.

[4]付朝暉,姚尚龍,袁世熒.鹽酸戊乙奎醚對膿毒癥致大鼠急性肺損傷時Toll樣受體4及NF-κB表達的影響[J].中華麻醉學雜志,2013,33(9):1134-1137.

(收稿：2015-03-20)

The influence of Toll receptor 4 in renal tubular epithelial cells of dexmedetomidine on rat injured by lipopolysaccharide

Department of Anesthesiology,The 4th Xi’an Hospital(Xi’an 710004)

Lei AnfengDuan JingChen Yanet al

Objective: To observe the effect of dexmedetomidine for Toll receptor 4 in renal tubular epithelial cells on rat injured by lipopolysaccharide,and explore the possible mechanism.Methods：Rat renal tubular epithelial cells and recovery, training,then they were added 10 ng/ml lipopolysaccharide(LPS)to culture and divided into A group(blank control group), group B(control group) was added 2.5 μg dexmedetomidine, group C (experimental group)was joined the 10μg atipamezole,2.5 μg dexmedetomidine after 30min, developing 12h,then took immunohistochemistry to measure expression of TLR4protein and TLR4mRNA, and determine the apoptosis rate of them. Results：Toll receptor 4 level was (45.1 ± 13.5) × 103in group B adopted dexmedetomidine and was lower than those of A and B group,(tBA=6.549，tBC=5.660，P<0.05)，B group’ TLR4mRNA was (0.46 ± 0.02)and lower than those of A and C group,(tBA=27.599，tBC=24.749，P<0.05).The apoptosis rate of group B was (34.6±7.6)% and significantly lower than that in A and C group(P<0.05).Conclusion： Dexmedetomidine can down Toll receptor 4 expression in renal tubular epithelial cells of rat injured by lipopolysaccharide, and the regulation for TLR4 of dexmedetomidine is related with α 2AR excited.

中國醫科大學附屬第一醫院內分泌科

R631.2

Adoi：10.3969/j.issn.1000-7377.2015.09.003

﹡遼寧省科技攻關計劃項目(2011225017)

主題詞腎疾病/化學誘導脂多糖類右美托咪啶/治療應用上皮細胞/代謝動物，實驗大鼠@TLR4