肺動脈高壓防治機制探討

河南省商丘醫學高等專科學校 (商丘 476000)　張　濤　王恩漫　王群讓

常鳳軍▲

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肺動脈高壓防治機制探討

河南省商丘醫學高等專科學校 (商丘 476000)張濤王恩漫王群讓△

常鳳軍▲

目的：研究大鼠肺高壓(PH)模型體內循環微粒(MPs)的改變及左旋精氨酸(L-Arg)對MPs的影響，探討肺動脈高壓的防治機制。方法：取18只SD雄性大鼠隨機分為三組(n=6)：對照組(C組)、MCT組(M組)L-Arg/MCT組(L組)。C組不做處理，通過腹腔注射野百合堿誘導M組和L組大鼠PH模型，隨后L組大鼠每日注射L-Arg，C組和M組每日注射等量的生理鹽水共3周。3周時測大鼠右心室壓力、取血提取MPs、檢測MPs含量及MPs對大鼠肺血管舒張功能的影響。結果：M組和L組的MPs含量較C組均升高(P<0.05)，且L組MPs含量較M組低(P<0.05)；M組和L組MPs對血管舒張功能的影響無顯著性差異(P>0.05)。結論：L-Arg通過減少肺高壓大鼠體內的MPs的含量而不是MPs的質量來改善肺高壓，進一步闡明了L-Arg 防治PH的分子機制。

肺高壓(Pulmonary hypertension, PH)嚴重危害了人民的健康，而且目前治療肺高壓的藥物價格不菲，這給患者帶來了沉重的經濟負擔。以往我們[1]及其他學者[2,3]的研究發現：左旋精氨酸(L-Arg)可以改善內皮功能進而緩解PH；循環微粒(MPs)通過以下途徑加重PH：降低肺血管內皮一氧化氮合酶(eNOS)和增加彈性蛋白表達；損害肺血管舒張功能。鑒于L-Arg與MPs對PH影響的交叉，我們將研究L-Arg 是否可以影響MPs對肺血管舒張功能的影響而緩解PH，以便進一步了解L-Arg防治PH的分子機制。

材料與方法

1 動物與試劑 18只雄性SD大鼠，體重約200±10g，均購自陜西中醫藥大學附屬醫院動物實驗中心。野百合堿 (Monocrotaline, MCT, sigma- aldrich，USA)，L-Arg (Sigma- Aldrich，USA)，K-H液試劑均為國產分析純，均購自國奧生物科技有限公司；戊巴比妥鈉(Sigma-Aldrich, USA)；RPMI 1640培養基(Gibico, USA)；BCA試劑盒(Thermo Scientific，USA)；重酒石酸去甲腎上腺素(Noradrenaline, Bitartrate, NA)，氯化乙酰膽堿(Acetylcholine chloride, Ach)，N -硝基-L-精氨酸甲酯(N- nitro-L-arginine methyl ester, L-NAME)購自Sigma-Aldrich。

2實驗儀器 MD 2 000生物信號采集系統購買自南京醫科大學，BI -420E+生物機能試驗系統購自成都泰盟科技有限公司，EDTA抗凝管、注射器購自BD，高速離心機購自Beckman coulter。

3建模及分組 PH模型按文獻制備[4]：生理鹽水和乙醇(2∶8)混合液溶解MCT為20 g/L的溶液，將L-Arg用生理鹽水配成150 g/L的溶液。18只大鼠隨機分為三組(n=6)：對照組(C組)、MCT組(M組)、 L-Arg/ MCT組(L組)。C組不做處理，M組和L組大鼠腹腔注射MCT 50 mg/kg誘導PH，之后L組每日腹腔注射L-Arg(500mg/kg)，C組和M組每日注射等量的生理鹽水共3周。

4檢測方法

4.1 肺動脈壓力測定: 3周結束時，戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉大鼠，BL-420E 生物機能試驗系統檢測右心室收縮壓(Right ventricular systolic pressure，RVSP)[3]以間接反應肺動脈壓力。

4.2 測定MPs： 肺動脈壓力測定結束后采腹主動脈血，參照文獻提取MPs[5]：首先離心(4℃ 11000g 2min)得到缺乏血小板血漿，然后取2ml缺乏血小板血漿再次離心(4℃ 13000g 45min)，棄去上清，用100ul RPMI 1640培養基重懸沉于管底的MPs。BCA試劑盒測定MPs蛋白濃度。

4.3 舒張功能：開胸取大鼠肺動脈，小心去除動脈周圍組織，將動脈剪為3～4 mm的血管段并移入預先通氣、(37±0.5)℃的K-H液(KH2PO41.2 mmol/L、MgSO41.2 mmol/L、CaCl22.5 m mol/L、glucose 11.0 mmol/L 、NaCl 118.0 mmol/L、KCl 4.7 mmol/L、NaHCO325.0 mmol/L)的浴皿中，調節MD 2 000生物信號采集系統。恒溫通氣，維持2g前負荷并讓血管環平衡1h，期間每15 min換1次K-H液。平衡結束后，加KEL(終濃度10-6mol/L)收縮3次，檢測血管環穩定性。然后后進行以下檢測：用MPs(1 mg/ml)刺激血管環30min后用NA(終濃度10-6mol/L)收縮血管環(Vmax)，然后用Ach(終濃度10-7～10-4mol/L)舒張血管并記錄相應張力值(Vach)，計算舒張率：(Vmax-Vach)/ Vmax。洗脫藥物后用L-NAME (100μmol/L)孵育血管環30 min，重復用NA和ACh處理血管環以檢測內皮依賴的血管舒張功能的變化。

結　果

1 三組大鼠RVSP比較M組為25.42±2.37 mmHg，較對照組(10.33±2.15 mmHg)明顯升高(P<0.05)，提示PH建模成功；L組的17.89±2.37 mmHg，較M組低有所減低，說明L-Arg可以緩解PH病情。

2三組大鼠MPs檢測結果比較見附表。 M組大鼠體內MPs含量較對照組明顯升高(P<0.05)，L-Arg減少一部分MPs的產生(L組)。

3三組大鼠血管舒張功能檢測結果比較見圖1～2。對照組血管舒張率為(90.7±3.43)%，M組為(40.63±8.32)%，提示MPs明顯抑制了肺血管的舒張功能。L-Arg(L組)組血管舒張率為(43.24±6.52)%，提示L-Arg并沒有緩解MPs對大鼠肺血管舒張功能的損害。

圖1　乙酰膽堿對血管舒張率的影響

圖2 MPs對大鼠肺血管舒張功能的影響( *與對照組比較，P<0.05)

附表　 三組大鼠

注：*與C組比較，P<0.05；#與M組比較，P<0.05

討　論

PH的病理機制復雜，多種內因子參與了PH的發生和發展，PH的肺血管阻力進行性增加，肺血管發生增殖及重塑[6]。一氧化氮(Nitric oxide，NO)是主要的血管內皮舒張因子。L-Arg作為內皮細胞合成NO的底物可以促進血管舒張，維持肺動脈壓力保持在正常水平。以往的研究顯示[1]：L-Arg可以上調eNOS蛋白的表達、抑制血小板的聚集、減少內皮素-1的產生、促進血管舒張而緩解PH。

MPs是在內皮細胞激活、發生凋亡時向周圍的環境中分泌的大小約0.1～1 Lm，是亞微米級的細胞顆粒[7]。Hugel B 和Wang JM研究發現體內MPs含量反映內皮損傷和功能障礙[4,7]。我們曾發現[3]：MPs可以減少二尖瓣內皮細胞中eNOS蛋白的表達并減少NO的產生。王旭蘭也發現[2]: MPs通過抑制肺血管中eNOS蛋白表達和上調彈性蛋白而加重肺高壓病情。鑒于MPs與L-Arg在肺高壓作用上有很多交叉之處，我們這次研究的假設就是：L-Arg是否是直接或間接通過作用于MPs而實現緩解肺高壓的。

本研究發現：L-Arg部分減少了PH大鼠體內增高的MPs，但是并沒有改善MPs對體外肺血管舒張功能的抑制作用。即：L-Arg通過為肺血管內皮細胞提供NO底物改善肺動脈壓力，進而減少MPs的含量和緩解MPs對肺高壓的加重，但是L-Arg并沒有改變MPs的質量(L-Arg沒有緩解M組大鼠體內MPs對離體肺血管舒張功能的抑制：L-Arg→PH↓→MPs含量↓(質量不變)→PH↓的循環)。我們的研究進一步闡明了L-Arg防治PH的機制，為今后尋求更好的防治PH的藥物提供理論依據。

[1] 常鳳軍，魏偉，歐志君，等. 左旋精氨酸恢復eNOS和iNOS平衡并制肺動脈高壓的研究[J].中華胸心血管外科雜志,2012，28(4):237-240.

[2] 王旭蘭. 循環微粒對大鼠肺動脈內皮的損害及與肺動脈高壓的關系[J].陜西醫學雜志,2015,44(1):12-14.[3] Ci HB, Ou ZJ, Chang FJ,etal. Endothelial microparticles increase in mitral valve disease and impair mitral valve endothelial function[J]. American Journal of Physiology- Endocrinology and Metabolism,2013,304(7): 695- 702.

[4] Hugel B, Carmen M, Martinez MC,etal. Membrane microparticles: two sides of the coin[J].Physiology,2005,20(1): 22-27.

[5] 王妍,陶軍,涂 昌,等. 高血壓病對內皮微顆粒水平的影響[J].中華老年心腦血管病雜志, 2006, 8(4): 222- 224.

[6] Grimminger F, Schermuly RT. PDGF receptor and its antagonists: role in treatment of PAH[J].Adv Exp Med Biol,2010,661(6):435-46.

[7] Boulanger CM, Amabile N, Guerin AP,etal. In vivo shear stress determines circulating levels of endothelial microparticles in end-stage renal disease[J].Hypertension,2007,49(4): 902-908.

(收稿：2015-03-20)

陜西省人民醫院心臟外科

R544.1

Adoi：10.3969/j.issn.1000-7377.2015.09.005

△陜西中醫藥大學附屬醫院心內科

主題詞 高血壓，肺性/藥物療法精氨酸/治療應用模型，動物大鼠