凝集素PSL通過下調(diào)HK2抑制前列腺癌細胞Warburg效應(yīng)的研究*

西安市兒童醫(yī)院兒科疾病研究所(西安 710002)　吳守振　武海濱　劉　萍

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西安市兒童醫(yī)院兒科疾病研究所(西安 710002)吳守振武海濱劉萍△

張紅▲

目的：研究凝集素PSL對前列腺癌Warburg效應(yīng)的影響。方法：采用色譜分離純化凝集素PSL，HPLC分析其純度。Real-time PCR 檢測己糖激酶2(HK2)、丙酮酸激酶2(PKM2)和磷酸果糖激酶(PFK)的表達。MTT方法檢測細胞活力。結(jié)果：色譜分離純化獲得了純度大于95%的PSL；PSL抑制了前列腺癌細胞PC3的細胞活力，降低了HK2的表達，抑制了PC3細胞的葡萄糖吸收和乳酸生成。結(jié)論：PSL通過下調(diào)前列腺癌細胞PC3細胞HK2的表達抑制其Warburg效應(yīng)，進而抑制了PC3細胞活力。

代謝異常是腫瘤的重要特征之一，腫瘤細胞即使在氧氣充足的條件下也通過糖酵解方式獲得能量，而不是通過三羧酸循環(huán)和氧化磷酸化。這種現(xiàn)象是細胞惡變過程中最為基礎(chǔ)的代謝改變之一，被稱為“Warburg效應(yīng)”或者有氧糖酵解[1]。已糖激酶(HK)、磷酸果糖激酶(PFK)、丙酮酸激酶(PK)是糖酵解過程中3個極為重要的限速酶。

植物凝集素是一類糖結(jié)合特異性非免疫原性蛋白質(zhì)或糖蛋白，廣泛存在于多種植物中。凝集素對多種細胞系具有凝血活性，毒性作用，抗增殖活性，抗腫瘤，免疫激活及抗真菌和抗病毒等多種生物學(xué)活性。研究表明：從刀豆種子中提取的一種新型凝集素---伴刀豆球蛋白A (ConA)，具有潛在的抗肝癌作用[2]。駱駝蓬凝集素對人類宮頸癌細胞(HeLa)，人類食管癌細胞(Eca-109) 和人類肝癌細胞( BEL-7404)等三種細胞系均具有抑制增殖的活性。其中，對人類宮頸癌細胞的抗增殖活性比較顯著，并可以誘導(dǎo)凋亡的發(fā)生[3]。

材料與方法

1 研究材料

1.1細胞： 前列腺癌細胞PC3購自上海細胞所。培養(yǎng)條件為37℃，5%CO2，培養(yǎng)基為含10%的DMEM培養(yǎng)基。

1.2主要試劑及儀器： 抗人HK2、PFK和PKM2單克隆抗體購自美國CST公司，轉(zhuǎn)染試劑X-treme GENE購自Roche公司，Real time PCR相關(guān)試劑及引物購自Takara公司。色譜儀為美國GE公司，HPLC儀器為美國Waters公司，Real time PCR儀為美國Life公司。

2 研究方法

2.1PSL的提取、純化： 從新鮮Polygonatum sibiricum Red中采用PBS低溫提取，硫酸銨分級沉淀粗提取，然后以陽離子交換(流動相為Tris-Cl，pH 7.0，線性洗脫)和分子篩層析(流動相為PBS，pH 7.2)進行純化。所得PSL進行HPLC鑒定其純度，流動相為PBS，pH 7.2。

2.2siRNA 干涉： 將前列腺癌細胞PC3接種至6孔板，待細胞密度達到80%～90%時準備轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染方法按X-tremeGENE說明書進行。HK2干涉片段和對照購自上海吉瑪公司。

2.3 細胞活力： 以3000個/孔將PC3細胞接種入細胞板，設(shè)3個復(fù)孔，以20 μg/ml PSL處理細胞，分別在24 h，48 h，72 h和96 h檢測。檢測時，在每孔細胞中加入100μl新鮮培養(yǎng)基。并將培養(yǎng)基另外加入4個孔，作為調(diào)零孔。加入10 μl MTT試劑，盡量保證加入均勻，無氣泡產(chǎn)生。放入細胞培養(yǎng)箱37℃，5%CO2孵育1 h。4 h后，加DMSO，溶解10 min。將96孔板放入96孔微板酶標儀讀數(shù)，參數(shù)設(shè)定：吸收波長440 nm，參考波長660 nm。實驗重復(fù)3次。

2.4葡萄糖消耗： 1×105個/孔PC3細胞接種到6孔板，加入20 μg/ml PSL處理24 h，將細胞培養(yǎng)液補足體積至2 ml，置于培養(yǎng)箱中進行48 h培養(yǎng)，條件為37℃、5%CO2。將培養(yǎng)液收集到1.5 ml EP管中，以初始細胞培養(yǎng)液葡萄糖量作為空白。按1∶200比例配制反應(yīng)液，并設(shè)置空白和標準對照。將反應(yīng)液混勻后在37℃水浴準確反應(yīng)15 min，以酶標儀測定吸光度值。實驗重復(fù)3次。

2.5乳酸生成： 1×105個/孔PC3細胞接種到6孔培養(yǎng)板，加入20 μg/ml PSL處理24 h，將細胞培養(yǎng)液補足體積至2 ml，置于培養(yǎng)箱中進行48 h培養(yǎng)，條件為37℃、5%CO2。將培養(yǎng)液收集到1.5 ml EP管中，以初始細胞培養(yǎng)液乳酸量作為空白。按樣本 0.02 ml，酶工作液 1 ml，顯色液 0.2 ml比例配制反應(yīng)液，并設(shè)置空白和標準對照。將反應(yīng)液混勻后在37℃水浴反應(yīng)10 min后，加入終止液2 ml，按100 μl/孔加入96孔板，以酶標儀測定吸光度值。實驗重復(fù)3次。

2.6 Western blot： 收集各種處理的細胞，用含蛋白酶抑制劑的裂解緩沖液，充分裂解。BCA法進行蛋白定量，取60 μg 處理好的蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳分析，120V恒壓轉(zhuǎn)移2 h，2% BSA室溫封閉30 min，將NC膜與待檢測的一抗室溫孵育1 h；PBST緩沖液洗膜3次，每次10 min，加入HRP標記的二抗，室溫孵育30 min。用ECL發(fā)光試劑盒處理NC膜，發(fā)光顯影。

2.7Real time PCR： 從處理的PC3細胞中提取RNA，定量后，取2 μg總RNA進行反轉(zhuǎn)錄制備cDNA。以cDNA為模板進行Real time PCR，反應(yīng)混合液為44 μl、Tag聚合酶1 μl，反應(yīng)終體積為50 μl。擴增條件為：95℃預(yù)變性2 min，然后93℃ 40 S，60℃ 35s，72℃ 30s共40個循環(huán)。以β-actin進行量化。設(shè)置3個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。

結(jié)　果

1 PSL的提取、純化和鑒定從Polygonatum sibiricum Red我們粗提了PSL，經(jīng)過陽離子交換(見附圖A)和分子篩層析(見附圖B)兩步層析方法進一步純化，SDS-PAGE初步鑒定(見附圖C)，Western blot 結(jié)果表明純化的PSL能夠與其抗體特異性結(jié)合(見附圖D)，HPLC檢測純化的PSL的純度為97%(見附圖E)。

附圖PSL純化鑒定結(jié)果[A:陽離子層析結(jié)果(箭頭為PSL峰)；B:分子篩層析結(jié)果(箭頭為PSL峰)；C:SDS-PAGE結(jié)果(箭頭為PSL)；D:免疫印跡分析結(jié)果；E:HPLC分析結(jié)果]

2 PSL抑制了前列腺癌細胞PC3的Warburg效應(yīng)我們分析了PSL對前列腺癌細胞的代謝影響，結(jié)果表明PSL明顯抑制了PC3細胞的葡萄糖吸收減少了1.76±0.18倍。PSL降低了PC3細胞降低2.43±0.25倍乳糖生成，提示PSL抑制了前列腺癌細胞的Warburg效應(yīng)。

3PSL下調(diào)前列腺癌細胞PC3的HK2表達我們觀察了PSL對Warburg效應(yīng)三個關(guān)鍵的限速酶表達的影響，Western blot和Real-time PCR結(jié)果表明PSL提高了PC3細胞中HK2的表達，而對PFK和PKM2的表達沒有影響(P>0.05)。

4 PSL抑制了前列腺癌細胞PC3的細胞活力 我們檢測了PSL對前列腺癌細胞活力的影響，PSL降低了PC3細胞活力。以siRNA抑制HK2的表達時，PSL對PC3細胞活力的抑制無影響(P>0.05)。

討　論

Polygonatum sibiricum Red和Polygonatum cyrtonema Hua為同科不同種植物。研究表明：Polygonatum cyrtonema Hua凝集素(PCL)對多種癌細胞具有顯著的抗增殖和凋亡誘導(dǎo)活性。PCL能誘導(dǎo)鼠纖維肉瘤L929 細胞凋亡，其糖結(jié)合特異性和凋亡誘導(dǎo)活性之間存在一種緊密的關(guān)系，這種凝集素誘導(dǎo)的凋亡機制與半胱天冬酶(Caspase)依賴途徑[4]和抑制 Ras/Raf 自救或抗凋亡途徑相關(guān)[5]。但是，Polygonatum sibiricum Red凝集素在腫瘤中的作用和機制還尚不清楚。

本研究對PSL前列腺癌細胞的增殖及代謝中的作用作了研究，初步探討了其機制。我們首先提取制備了PSL，從Polygonatum sibiricum Red中，采用硫酸銨分級沉淀粗提了PSL，進一步利用兩步層析(陽離子層析和分子篩層析)，我們制備了純度大于95%的PSL，制備的PSL能夠與其抗體特異性結(jié)合。本研究我們制備的PSL純度較高，制備方法簡單。

Warburg效應(yīng)是腫瘤代謝異常的主要表現(xiàn)形式，為腫瘤的生長提供能量、代謝物質(zhì)，促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展。其中，葡萄糖的極大吸收和乳酸生成是腫瘤Warburg效應(yīng)的重要特征[6]。前列腺癌是男性生殖泌尿系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一[7]，隨著我國人口老齡化和生活方式的改變，前列腺癌發(fā)病率明顯增高。更為重要的是，大部分前列腺癌患者發(fā)現(xiàn)時已為晚期[8]。本研究中，我們觀察了PSL對前列腺癌代謝的影響。我們的研究結(jié)果顯示PSL能夠明顯抑制PC3細胞的葡萄糖吸收和乳酸生成，提示PSL改變了前列腺癌的代謝異常。進一步，我們檢測了PSL對前列腺癌細胞活力的影響，正如我們預(yù)期的，PSL明顯抑制了前列腺癌的細胞活力，抑制了其生長，這些研究結(jié)果表明：PSL通過抑制前列腺癌Warburg效應(yīng)而抑制腫瘤生長，為PSL在腫瘤中的作用提高依據(jù)。

已糖激酶(HK)、磷酸果糖激酶(PFK)、丙酮酸激酶(PKM)是糖酵解過程中3個極為重要的限速酶。其中，HK2是腫瘤Warburg效應(yīng)中的第一個限速酶，是腫瘤治療的一個潛在靶點[9]。HK2在許多腫瘤組織中表達的量及活性增加明顯增高，當病灶發(fā)生轉(zhuǎn)移時，表達更高[10]，HK2在前列腺癌組織中表達水平明顯高于良性前列腺增生及正常前列腺組織[11]。本研究中，我們檢測了PSL對Warburg效應(yīng)3個限速酶的影響。我們發(fā)現(xiàn)：PSL抑制了前列腺癌PC3細胞HK2的表達，而對PFK和PKM2的表達沒用影響，表明PSL是通過下調(diào)HK2的表達抑制了前列腺癌細胞的Warburg效應(yīng)。細胞活力實驗進一步證實了我們的實驗結(jié)果。當以siRNA干涉HK2的表達時，PSL對前列腺癌細胞活力的抑制能力消失。

總之，通過本研究，我們制備了純度較高的PSL，觀察了其對前列腺癌Warburg效應(yīng)的影響，發(fā)現(xiàn)PSL能夠通過下調(diào)HK2的表達抑制前列腺癌細胞的Warburg效應(yīng)，進而抑制前列腺癌細胞活力，提示PSL可能是前列腺癌較好的一個治療藥物。

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(收稿：2015-04-30)

陜西省中醫(yī)藥研究院

R737.25

Adoi：10.3969/j.issn.1000-7377.2015.09.007

* 陜西省科技廳社會發(fā)展攻關(guān)項目(S2012ZY241)

△ 陜西中醫(yī)藥大學(xué)

主題詞 前列腺腫瘤/藥理學(xué)前列腺腫瘤/血液