基于COI基因的搖蚊亞科部分屬的系統發育分析（雙翅目：搖蚊科）

姜 麗，閆 嬌，王婷婷，郭 琴，王新華，閆春財

（1.天津師范大學a.生命科學學院，b.天津市動植物抗性重點實驗室，天津300387；2.南開大學 生命科學學院，天津300071）

搖蚊科隸屬雙翅目長角亞目（Diptera：Nematocera），搖蚊科種類約占淡水湖沼生物區系的25%，其幼蟲生物量約占底棲動物總量的70%～80%.由于搖蚊科昆蟲具有個體相對較大、易獲得、生活習性多樣、區域性強、底棲生活等優點，因此是監測水體環境和污染狀況的優良指示生物[1].

搖蚊亞科是搖蚊科中僅次于直突搖蚊亞科的第2大亞科，目前對搖蚊亞科的研究相對較少.搖蚊亞科有3個族：搖蚊族（Chironomini，至少 69個屬）、長跗搖蚊族（Tanytarsini，至少16屬）和偽搖蚊族（Pseudochironomini，至少5屬）.由于形態學和核型特征的不同造成了復雜的物種多樣性和較小的屬間差異，出現了基因重組和趨同進化，導致物種鑒定的難度加大和搖蚊物種分類地位的不明確.為解決這一問題，近年來分子系統學利用標記基因在物種分類方面取得了一些進展.這些標記基因的特點是多態性高、共顯性遺傳、選擇中性、容易獲得、容易操作及重復性好.線粒體細胞色素氧化酶I基因（COI）自2004年以來被廣泛應用于昆蟲的條形碼研究[2].迄今，一個包含超過8萬種昆蟲信息的數據庫已經形成[3].廣泛多態性和豐富的可用數據使COI基因成為一個能夠鑒定物種多樣性的分子系統學工具.Guryev[4]第一次嘗試基于COI的核苷酸序列和線粒體DNA的細胞色素b基因（Cytb）研究搖蚊科的系統發育.然而，Guryev僅利用了幾個屬（Chironomus、Kiefferulus、Sergentia、Polypedilum和Axarus）建立系統發育樹來反映亞科的系統發育關系.此后，Sharma[5]基于rDNA的ITS1和ITS2建立系統發育樹，確定了搖蚊族9個屬的物種地位.Ekrem等[6]基于線粒體COI基因的核苷酸序列獲得了長跗搖蚊族（Tanytarsini）5個屬的親緣關系，包括2個核基因（FE1和CAD）及3個線粒體基因（COI、COⅡ和16s RNA）的分析[7].關于Chironomus和Sergentia的屬內關系[8-11]也有少量報道.迄今為止，所有的搖蚊亞科系統發育重建均包含數目有限的屬和種，屬間系統發育關系仍然不明確.

本研究基于搖蚊亞科39屬48種的COI基因序列，擬重建搖蚊亞科屬級之間的系統發育關系.

1 材料和方法

1.1 樣品來源

實驗所用的搖蚊樣品主要來自野外采集，采集方式包括網捕和燈誘.標本放置于－20℃的冰箱中保存.經形態學初步鑒定，供系統發育研究的搖蚊樣本詳細信息如表1所示，在GenBank下載的25種搖蚊COI基因的相關序列信息如表2所示.

表1 實驗樣品來源Tab.1 Sourceof samples

表2 25種搖蚊COI基因的相關信息Tab.2 Information of COI genesof 25 species

1.2 DNA的提取

取頭部、觸角、翅、足、腹部和生殖節，用加拿大樹膠做永久裝片，為種類鑒定提供依據，剩下的胸部用于DNA提取.使用天根生化科技有限公司生產的血液/細胞/組織/基因組DNA提取試劑盒，按照使用說明書，微調部分操作步驟進行DNA提取.

1.3 PCR擴增

對COI基因進行擴增使用的是通用引物LCO1490（5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3′）和 HCO-2198（5′-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAAT-CA-3′）.這2個引物組合能夠擴增長度大約為1 kbp的片段.大多數個體都能用這段引物擴增得到相應序列.

PCR反應體系為25μL，包括：ddH2O 16.2μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）2 μL，上游和下游引物（10μmol/L）各 1μL，Taq酶（500 U，2.5 U/μL）0.3μL，DNA 模板2μL.

PCR反應條件：95℃預變性5 min；95℃變性40 s，56℃退火40 s，72℃延伸1 min，32個循環，最后72℃延伸5 min，溫度降低到4℃終止擴增.得到的PCR產物用質量分數1%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，經檢測符合要求的產物送北京華大基因研究中心測序.

1.4 實驗數據的處理和分析

所測得序列先進行校對，然后在NCBI進行BLAST比對，得到的同源序列絕大多數來自昆蟲綱線粒體基因組細胞色素氧化酶 I（Cytochrome oxidase I，COI）的目標DNA片段，在排除了外源基因污染后，經過比對再將確認無誤后的序列采用BioEdit 7.01軟件進行比對，去掉兩端不整齊的序列.

2 基于COI基因序列的系統發育分析

2.1 COI基因序列的堿基組成

利用MEGA5.1軟件對搖蚊亞科48種搖蚊的基因序列進行分析，結果如表3所示.序列總長度平均為698 bp，序列中各堿基含量的平均值是：A=29.3%，T=37.7%，G=14.7%，C=18.3%，（C+G）含量（33%）遠低于（A+T）含量（67%），表現出明顯的堿基偏倚性，這與絕大多數昆蟲線粒體的基因具有一致性.

在比對的序列中，C（保守位點數）占69.6%（486/698），V（變異位點數）占24.6%（172/698），Pi（簡約信息位點數）占 16.1%（113/698），S（自裔位點數）占5.73%（40/698）.密碼子第2位點較為保守，其保守位點數占全部保守位點數的49.8%（242/486）.密碼子第3位點可變數占全部可變位點數的84.8%（146/172），而且簡約信息位點也集中在第3位點上，其比例為62.5%，由此可見密碼子第3位點上的堿基進化速率較快.

表3 搖蚊亞科48種搖蚊COI基因序列信息Tab.3 Information of COI gene sequencesof 48 species from Chironom inae

2.2 密碼子氨基酸組成分析

對搖蚊亞科48種搖蚊的密碼子使用頻率進行統計，結果如表4所示.該序列編碼了212種氨基酸，富含AT的密碼子包括：亮氨酸（Leu L）的使用頻率（CU）和相對使用頻率（RSCU）值范圍分別為2.9～9.0和0.64～1.98；甲硫氨酸（Met M）的CU和RSCU值范圍分別為0.0～1.8和0.00～1.00.富含GC的密碼子包括：甘氨酸（Gly G）的CU和RSCU值范圍分別為0.3～1.6和0.22～1.27；脯氨酸（Pro P）的CU和RSCU值范圍分別為 0.6～3.1和 0.32～1.56；精氨酸（Arg R）的 CU 值和RSCU值范圍分別為0.2～0.6和0.27～0.71.苯丙氨酸（F）使用量最高；其次是異亮氨酸（I）；再次是酪氨酸（Y）.因此COI基因表達產生的氨基酸在組成上具有一定的偏向性，AT密碼子的相對使用頻率大于GC密碼子的相對使用頻率.

表4 搖蚊亞科48種搖蚊的密碼子使用頻率Tab.4 Codon usage frequency of 48 species in Chironom inae

2.3 堿基替換分析

對搖蚊亞科48種搖蚊的COI基因進行堿基替換分析，結果如表5所示.總轉換數為84，總顛換數為105，轉換略低于顛換.不同密碼子之間的堿基替換具有差異性.密碼子第3位點上出現了較為明顯的堿基替換，替換比例達到7%（70/189），其中轉換占全部轉換數的 34.5%（29/84），顛換占 39%（41/105）.第 2 點位點最為保守，只有26.9%（51/189）的替換率，分別占轉換發生數的32.1%（27/84），顛換發生數的22.8%（24/105）.內群平均轉換比顛換（R 值）=0.8，小于 1，表明堿基替代未達到飽和.

表5 搖蚊亞科48種搖蚊COI基因序列基因堿基替換Tab.5 Nucleotidessubstitution of COI gene sequencesof 48 species in Chironom inae

2.4 COI基因序列堿基替換飽和度分析結果

利用MEGA 5.1軟件對搖蚊亞科48種搖蚊COI基因進行堿基替換飽和度分析，結果如圖1所示.

圖1 COI基因轉換顛換數與p距離的關系Fig.1 Relationship between COI gene conversion and transversion with p-distance

從圖1可以看出，轉換數（Ts）和顛換數（Tv）大部分重合，呈直線分布，隨著p距離的增大而增多，顛換略高于轉換，但兩者沒有明顯的飽和趨勢.同Tv相比，Ts與p距離的線性關系更強，堿基替換未達到飽和.推測顛換數高于轉換數的原因與COI序列中（A+T）含量較高有關，因為高（A+T）含量增加了A-T顛換的幾率.

2.5 遺傳距離分析

計算48種搖蚊之間未校正的p距離，結果顯示：搖蚊亞科內各屬間p距離的變化范圍為0.061～0.183；而外群環足搖蚊屬與搖蚊亞科間的p距離的變化范圍則為0.013～0.156，所有序列的平均p距離為0.201.

2.6 系統發育關系的構建

以環足搖蚊屬的5個種作為外群，使用MEGA5.1軟件構建基于Kimura-2-parameter模型的鄰接法（NJ）和最大簡約法（MP）的48種搖蚊的系統發育關系，結果如圖2和圖3所示.以重復抽樣分析（Bootstrap test）1 000次來檢驗分子系統樹各分支的置信度.2種建樹方法得到的拓撲結構基本一致.

圖2 基于COI基因序列構建的48種搖蚊的NJ樹Fig.2 NJ tree of 48 speciesof Chironom inae based on COI gene sequences

圖3 基于COI基因序列構建的48種搖蚊的MP樹Fig.3 MP tree of 48 species of Chironom inae based on COI gene sequences

3 討論

本研究中NJ樹和MP樹形成的拓撲結構基本相似，所反映的部分屬間關系情況大致相同.搖蚊亞科的2個屬群的進化基本得到了解決，出現了2個明顯的進化枝.總體上系統發育關系支持了形態學上鑒定的屬和大部分種的地位.搖蚊亞科包括兩大有區別的集群：搖蚊族和長跗搖蚊族，它們在約8 500萬年以前開始分化，這些族的代表屬在形態學特征上有顯著不同.目前分類學家分辨出的Pseudochironomini的代表屬在Dillon等[11]構建的系統發育圖中沒有形成一個分支，Pseudochironomus sp.和Chironomini的屬在一個進化枝上，其分類地位還不明確.搖蚊亞科和直突搖蚊亞科的代表種形成約在104萬年以前，與古生物學家鑒定的白堊紀搖蚊[12]的形態相一致.105萬年以前的一個搖蚊亞科的代表—狹搖蚊屬，從搖蚊亞科和直突搖蚊亞科之間單獨形成一支.在本研究中，多足搖蚊屬群中的內搖蚊屬（Endochironomus Kieffer）、倒毛搖蚊屬（Microtendipes Kieffer）、明搖蚊屬（Phaenopsectra Kieffer）和斑搖蚊屬（Stictochironomus Kieffer）很好地聚集在一起，有很近的親緣關系，與形態學的分類一致.分類學家依據一些相似的特征（如觸角13鞭節，下唇須5節，中足具一內一外2根短脛距及偶爾外脛距退化，上、下附器、肛尖形狀變異情況以及有或無中附器等）將11個近緣的屬聚為多足搖蚊屬群.長跗搖蚊屬群中桿長跗搖蚊屬（Virgatanytarsus）和長跗搖蚊屬（Tanytarsus），小突搖蚊屬（Micropsectra）和流長跗搖蚊屬（Rheotanytarsus）很好地聚集在了一起，與形態學的分類一致，還有一些同屬群的物種個體并沒有聚類在一起.Cranston[13]在1989年編制的屬級鑒別特征，依據非常長的中附器、V型的臀板帶、肛尖頂尖、指附器未伸出上附器內緣等相似特征將31個近緣屬聚為長跗搖蚊屬群，但是其中泉搖蚊屬（Krenopsectra）和長跗搖蚊屬（Tanytarsus）聚為姐妹群，這與形態學分類有明顯差異.多數基于形態學研究的系統發育關系顯示：狹搖蚊屬（Stenochironomus）和明搖蚊屬（Phaenopsectra）互為姐妹群，但是在本研究中這2個類群并沒有聚合在一起形成姐妹群關系.在本文中顯示較高支持率的姐妹群為：阿克西搖蚊屬（Axarus）和異足搖蚊屬（Apedilum）、二叉搖蚊屬（Dicrotendipes）和枝角搖蚊屬（Cladopelma）.由于目前尚無分子系統學和形態學研究的相關報道，本文結果有待進一步驗證，在今后研究中需要增加更多的基因序列進行聯合分析.

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