RNA靶向基因組編輯技術CRISPR/Cas9在昆蟲中的研究進展

張婷婷 ，柳偉偉 ，b，李 濤 ，張 敏 ，張學堯 ，馬恩波 ，張建珍

（山西大學a.應用生物學研究所，b.生命科學學院，太原 030006）

基因組編輯技術是近年來發展最快的分子生物學和細胞生物學技術之一.CRISPR/Cas9系統是RNA介導的基因組編輯系統，由導向RNA（Single guide RNA，sgRNA）與靶標基因的DNA片段匹配，指導Cas9蛋白對基因組序列進行識別和切割，進而對靶標基因進行編輯.相對于鋅指核酸酶（ZFNs）和轉錄激活因子樣效應物核酸酶（TALENs），CRISPR/Cas9系統構建方法簡單，打靶效率高，易于操作，日益受到基因編輯相關研究人員的廣泛關注.

1 CRISPR/Cas9技術簡介

1.1 CRISPR/Cas9系統的結構

CRISPR全稱為成簇規律間隔短回文重復（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats），這是一類廣泛分布于細菌和古細菌基因組中的重復結構，是細菌對外源DNA（噬菌體等）入侵建立的獲得性免疫系統.CRISPR由一系列短重復片段（Repeat序列）和不同的外源DNA序列間隔（Spacer）排列組成，其位點數量及中間的重復序列數量在不同物種間存在差異，該間隔序列與噬菌體/質粒的序列同源，從而為宿主細胞對抗外源感染提供了可能.Cas基因是CRISPR位點的保守相關基因（CRISPR-associated genes，Cas genes），是細菌獲得免疫防御的基本元件，其蛋白能夠切割核酸的功能結構域，可依據位點特異性將入侵生物DNA片段進行切割，如圖1所示.

圖1 細菌獲得性免疫原理圖[1]Fig.1 Diagram of princip leof acquired immune in bacteria

外源基因首次進入細菌中時，CRISPR系統會識別外源基因中帶有的原型間隔序列毗鄰基序（Protospacer adjacent motif，PAM）（NGG）序列，并將其上游約30 nt的序列剪切后插入CRISPR的2個Repeat中形成新的Spacer，從而獲得免疫記憶.當外源基因再次進入細菌時，CRISPR在前導序列（Leader）的作用下起始轉錄，轉錄得到的前體RNA（Pre-crRNA）在相關核酸酶的作用下被剪切成小的含有Spacer的發夾RNA（crRNA）.crRNA與相關Cas蛋白可共同識別Spacer對應的外源基因序列，并實現對外源DNA的切割，以發揮免疫功能[1].

1.2 CRISPR/Cas9的作用機制

目前，在細菌中已發現3種不同類型的CRISPR/Cas系統，其中第2型的組成較為簡單，由Cas9蛋白及導向RNA組成，這一類型被科學家們高度關注并嘗試應用于多種生物的基因組修飾.在該系統中，Cas9蛋白由1 049個氨基酸組成，含有RuvC-like和HNH結構域，能夠分別切割靶序列的2條鏈.crRNA結構中的Spacer序列位于5’端，Repeat序列位于3’端，其中Repeat序列能夠與tracrRNA的部分序列相互匹配，形成新的嵌合體導向RNA，該RNA介導Cas9蛋白與靶基因的識別和切割.核酸酶結構域可以切割與crRNA互補配對的模板鏈，切割位點位于PAM上游3 nt處，RuvC-1ike結構域可以對另一條鏈進行切割，切割位點位于PAM上游3～8 nt處，如圖2所示[2].研究發現，將crRNA與tracrRNA用1個CAAA的Loop環連接后融合表達（sgRNA），該系統仍能發揮切割功能[3]，并具有對細菌、酵母和哺乳動物等多種生物基因組的切割活性.

圖2 CRISPR/Cas9基因組編輯機理[4]Fig.2 Mechanism of CRISPR/Cas9 genomeediting technology

CRISPR/Cas9技術對基因組的定向編輯是通過在基因組特定位置上造成雙鏈斷裂（doublestrand breaks，DSBs），控制DNA修復途徑，對基因組定點修飾來實現的.一般來說，基因組DNA在受到損傷，形成雙鏈切口DSBs后，機體會通過3種機制對DNA進行修復，即非同源重組末端連接（non-homologousend joining，NHEJ）修復、同源重組（homologous recombination，HR）修復和單鏈退火（singlestrand annealing，SSA）修復，原理如圖3所示.

圖3 DSBs介導的基因組修復原理圖Fig.3 Pathway of gene repairs mediated by DSBs

NHEJ主要發生在細胞周期的G1期，將斷裂的雙鏈DNA直接連接而進行修復，可引起DSBs附近產生堿基變換、插入或者缺失（indels）；HR則發生在細胞周期的G2和S期，供體DNA（Donor）通過同源臂的作用進行精確修復；SSA修復常引起重復單元被刪除，這是因為其發生DSBs的位置附近有較長的重復序列，經核酸外切酶加工所形成的單鏈末端依據堿基互補配對原則連接而修復.若CRISPR/Cas9系統所造成的DSBs位置在功能基因的外顯子處，則通過NHEJ與SSA修復方式可造成該功能基因失活；此時若引入連接有該基因同源臂的候選基因或者篩選基因（Neo/puro）序列作為供體，則可在DSBs處通過HR修復，將篩選基因（Neo/puro）或者候選基因序列插入至功能基因的指定位點，實現在失活功能基因的同時引入新的候選基因，可用于基因缺失細胞系的篩選或者物種自身基因及外源新候選基因的功能研究.

1.3 CRISPR/Cas9技術的效率及脫靶效應的影響因素

CRISPR/Cas9技術依靠sgRNA對PAM區上游20 nt靶序列的識別，在PAM上游3 nt處進行切割，進而實現對基因組的定點修飾.因此影響該技術效率的因素主要有PAM序列的組成、sgRNA的組成及結構、物種、細胞類型以及篩選方式等.

PAM序列主要決定靶位點的位置及切割效率.最初報道在細胞水平上PAM序列為NGG時該系統的切割效率最高[4]，而對酵母的研究[5]發現，PAM序列為NGNGG時，能顯著提高CRISPR/Cas9的特異性和切割效率.

sgRNA與靶位點區結合的序列、長度和結構是CRISPR/Cas9靶向特異性的保證.靠近PAM序列的8～14 nt的區域是保持其特異性的關鍵[3，6-7]，其余序列也在不同程度上影響脫靶效應.sgRNA縮短為17 nt，切割效率未明顯下降，但可有效降低脫靶效應[8]，增加sgRNA識別序列的長度也可降低CRISPR/Cas9系統的脫靶效應，提高其特異性，但對切割效率稍有影響[9].Xu 等[5]從嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）基因組中克隆得到Cas9全長基因，建立了Cas9和引導RNA（gRNA）的酵母和哺乳動物細胞載體及報告系統，并對gRNA不同組成元件，包括靶位點序列長度（Target Length）、匹配區長度（Repeat Length）、莖環結構（Loop）和tracrRNA長度及靶位點序列中PAM的堿基組成進行系統優化，優化后的CRISPR/Cas9核酸酶系統獲得更高的切割效率.該研究2014年被加拿大醫藥研究資訊公司Global Medical Discovery收錄為Key scientific article.

CRISPR/Cas9系統在不同物種、不同細胞類型及修復方式下，其基因編輯效率存在差異[10].Ren等[11]建立了哺乳動物細胞水平surrogate reporter檢測系統，經過FACs或puro篩選，以NHEJ和SSA介導為手段檢測CRISPR/Cas9介導的基因修復效率，發現該篩選系統能將修復效率提高34倍.Maruyama等[12]發現將抗腫瘤因子Scr7加入到CRISPR/Cas9體系中，可抑制DNA ligase IV的活性，降低DSBs修復時NHEJ的效率，從而在哺乳動物細胞水平將HR的修復效率提高19倍.針對不同的應用目的，可根據物種和細胞品系類型，對Cas9蛋白進行優化，并對sgRNA和PAM序列及結構進行適當優化，建立相應的篩選系統，可提高基因編輯效率.

2 CRISPR/Cas9技術在昆蟲學研究中的應用

CRISPR/Cas9技術已經在人類細胞[13]、大鼠Rat[14]、小鼠 murine[15]、斑馬魚 zebrafish[16]、牛 bovine[17]、羊 goat[18]、線蟲（Caenorhabditis elegans）[19]等生物中成熟應用，但在昆蟲中該技術僅在果蠅、家蠶和埃及伊蚊等的研究中有報道.

2013年初，Gratz等[20]率先使用CRISPR/Cas9技術對果蠅的Yellow及Rosy基因實現定點敲除，并進行多位點編輯、長片段刪除與同源重組修復.同年6月，Bassett等[21]通過在果蠅syncytial blastoderm-stage的胚胎中注射Cas9 mRNA和sgRNA的復合物，針對Yellow基因獲得了88%的編輯效率，得到穩定的遺傳突變性狀，并利用HRMA技術對基因編輯效率及脫靶效應進行了檢測.同年7月，Yu等[22]同樣利用CRISPR/Cas9技術對果蠅進行基因組編輯，通過Yellow基因等7個位點的驗證，實現該技術在染色體上進行基因敲除和片段插入.同年9月，Kondo等[23]構建了生殖細胞特異性表達Cas9的轉基因果蠅品系與表達sgRNA的果蠅品系，二者雜交后代為特異性基因敲除品系，為CRISPR/Cas9系統在果蠅中的應用提供了新的途徑.2013年10月，Wang等[24]在家蠶中建立了CRISPR/Cas9系統，通過在家蠶卵期注射Cas9的mRNA與sgRNA混合物，成功敲除家蠶BmBLOS2基因，實現了“油蠶”表型.2014年，Liu等[25]報道在家蠶細胞中利用CRISPR/Cas9系統可同時實現6個基因的敲除；同時在家蠶個體敲除Bm702基因并在該位點實現外源基因插入[26].Wei等[27]在家蠶卵中注射Cas9 mRNA和sgRNA，可對Bm-ok、BmKMO、BmTH和Bmtan進行基因編輯，獲得的Bm-ok基因敲除家蠶品系通過與野生型或者嵌合體自交，在子一代分別獲得28.6%和93.6%的雙等位基因敲除個體.2014年，多個課題組利用CRISPR/Cas9系統對果蠅進行基因插入、基因激活及抑制表達的研究[28-30]，為該技術在基因功能研究中的進一步應用提供了新的思路.Kistler等[31]在埃及伊蚊產卵后的3h內注射sgRNA與Cas9重組蛋白混合物，敲除基因Wtrw并引入帶有stop位點的ssODN供體片段；通過CRISPR/Cas9系統對靶標基因DNA進行切割，形成DSBs，通過HR修復，在埃及伊蚊內插入ECFP閱讀框，其后代可在熒光顯微鏡下顯示藍色以便于觀察.盡管定向基因組編輯技術已經在上述昆蟲中成功應用，但對于種類龐雜的昆蟲類群來說，還需要科研工作者進行多種嘗試，實現該技術在多種昆蟲類型中的應用，為進一步研究基因功能提供新的技術手段.

定向基因組編輯技術，如ZFNs、TALENs和CRISPR/Cas9，在不同物種中使用時均需要滿足一些必要條件：如基因序列及結構已知，有可穩定遺傳的細胞系或原代細胞分離技術，成熟的受精卵注射技術及孵化技術等.昆蟲是自然界中物種數量最多的類群，基因組結構復雜，測序難度大，遺傳背景多樣，受精卵注射及體外孵化條件建立困難.因此，在不同昆蟲中應用基因組編輯技術建立突變品系及進行基因功能研究難度很大.但是，已有一些科學家經過不懈的努力，利用ZFNs和TALENs技術成功地對蟋蟀Lac2基因進行基因編輯，為基因組編輯技術在不同昆蟲中的應用提供了新的思路和技術手段[32].

飛蝗為世界性農業害蟲，也是典型的漸變態類昆蟲.近年來，以飛蝗基因組測序完成為契機，探索害蟲防治新型分子靶標成為研究熱點.雖然飛蝗對RNA干預（RNAi）敏感，筆者所在團隊前期已經利用RNAi技術對幾丁質代謝酶家族基因進行干擾，并對10個相關基因的功能進行了初步研究[33-36].但發現RNAi干擾在特定時期（如卵期）、特定系統（如生殖系統）或特定基因（如一些轉錄因子）中存在沉默效率低的問題，無法對所有感興趣的靶標基因進行功能研究.CRISPR/Cas9技術能在基因組水平對靶標基因進行敲除或者修飾，將有可能成為飛蝗基因功能研究的新工具.康樂院士課題組對龐大的飛蝗基因組序列進行測序和解析，發現飛蝗基因組結構較為復雜，擁有大量的重復序列，包含大量的DNA轉座子和重復序列LINE反座子，造成基因組異常龐大，其基因組圖譜約為6.5 Gb，是果蠅基因組大小的30余倍，約為人類基因組的2倍多，是迄今為止已知的最大的動物基因組[37].這一成果為利用CRISPR/Cas9技術對飛蝗基因組進行操作提供了可能.在此基礎上，結合EST和轉錄組數據庫，采用Race反應獲得全長cDNA序列，進一步通過設計合適引物，結合Genome-walking可從基因組DNA擴增獲得部分基因組序列，與cDNA序列比對后，即可知其內含子與外顯子的位置，進而設計與靶標基因相應的sgRNA序列.同時本課題組成功建立了離體培養的飛蝗胚胎細胞系及外源基因轉染技術，可結合CRISPR/Cas9技術在細胞水平對靶標基因功能進行初步驗證，為后續在活體水平研究提供基礎數據，以期完成對害蟲靶標基因的篩選和驗證，從而為飛蝗綠色防控提供新的技術手段.

3 技術展望

CRISPR/Cas9技術是近年來發展最快的基因組編輯技術之一，因其操作簡單、成本低、可實現多個基因的同時操作，大部分分子生物學和細胞生物學實驗室均可建立該技術體系，因此在未來的基因組編輯及基因功能研究中具有重要的應用價值.

對CRISPR/Cas9系統進行適當改造，將為基因功能研究提供新的思路和技術手段.Cas9n系統可將Cas9蛋白的第10位氨基酸由D轉換為A，使其只切割靶位點的單鏈，Cas9n可在每個sgRNA結合點造成單鏈切口，2個相鄰的單鏈切口則形成1個DNA雙鏈斷裂，如此就能實現NHEJ介導的基因編輯，這大大提高了CRISPR/Cas9系統的特異性，并降低其脫靶效率.而dCas9系統將Cas9蛋白失活，通過偶聯不同的輔助功能蛋白，如FokI等，可實現更為精確的基因組切割和編輯，若為轉錄激活域（VP16或VP64），則可在體內對靶基因進行激活.若在其后連接甲基化酶，調控靶位點的甲基化水平，可用于表觀遺傳學研究.CRISPRi通過對靶位點的識別，可逆地對轉錄延伸和RNA聚合酶的結合進行阻滯，進而對靶標基因進行沉默[4].Konermann等[38]通過對CRISPR系統進行改造，在活細胞中可有效激活任何基因，用于對人類細胞中全基因組的功能基因篩選和特定疾病的基因鑒定.這些具有基因編輯、基因激活、抑制以及調控功能的CRISPR/Cas9家族成員，將為未來基因功能研究、調控、害蟲防治乃至基因治療等方面提供新型技術手段和研究思路.

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