堿解法測定中華鱉肝臟RNA-DNA含量比值方法的改進

冀芳爍，楊振才

（河北師范大學生命科學學院，石家莊050024）

中華鱉是古老的次生水生爬行動物，隸屬于龜鱉目（Testudinata）鱉科（Trionychidae），在動物界占有獨特的地位.中華鱉是營養豐富的水生動物，在其養殖和資源管理的研究中，生長情況是最重要的研究指標之一.水生動物的生長速度多采用測定一段時間內動物體重的變化來獲得，對于野生動物而言獲得其生長速度困難，且無法反映動物的瞬時生長狀況.近年來，許多學者開始探尋能夠反映動物瞬時生長狀況的指標.RNA-DNA含量比值（CRNA/CDNA）可以用來指示動物的生長速度、營養狀態、健康狀態以及生長潛能[1-4].RNA-DNA含量比值較傳統營養生長指標能更加靈敏、快速地反映出動物體生長發育和營養狀態的變化，能夠對幾小時或幾天內的環境變化做出反應，而傳統生長指標是較長時間內動物生長狀況的平均值[5-7]，會掩蓋瞬時的生長變化.

RNA-DNA含量比值作為瞬時生長指標的應用是基于如下假設：細胞中總RNA表達量會隨著蛋白合成需求的增加以及動物體的生長而相應增加[1]，而每個細胞內DNA的含量是相對恒定的.因此RNA-DNA含量比值可以反映細胞積累合成蛋白的能力，被認為是能夠反映生長的可靠指標[2-5].

堿解法測定動物組織內RNA-DNA含量比值的原理是RNA能夠被堿解為酸溶性核苷酸，而DNA不會被分解.利用堿液和不同濃度的高氯酸使同一組織內的RNA和DNA分別沉淀分離，再通過紫外分光光度法測定其含量[8].

本實驗整合了Buckley[9]和Robbins[10]發表的堿解法操作流程，以此作為基礎，結合其他已發表的使用堿解法測定RNA-DNA含量比值的研究，比較操作細節中的差異，優化離心速率、37℃堿解水浴時間和堿解量.本研究旨在規范堿解法測定中華鱉肝臟組織RNA-DNA含量比值的操作流程，提升測量的穩定性和準確性，為今后相關實驗提供方法上的參考.

1 材料和方法

1.1 勻漿液的制備

勻漿器中加入1 mL勻漿介質，冰上預冷.取同一中華鱉肝臟組織100 mg，冰上充分研磨3～5 min至無組織塊存在.研磨后將勻漿液吸出，分裝入2 mL離心管中，每管0.7 mL.同時還需要做2個空白對照，即在離心管內加入0.7 mL勻漿介質.

1.2 堿解法基本操作流程

加入0.35 mL濃度0.6 mol/L的PCA，冰浴15 min，4℃下相對離心力為10 000×g（N（r/min）=[G/（1.12×離心10 min.棄上清，沉淀加入1 mL濃度為0.2 mol/L的 PCA，4℃下 10 000×g離心 10 min.棄上清，沉淀加入0.7 mL濃度為0.3 mol/L的KOH，37℃水浴2h.之后冰浴10 min，加入0.35 mL濃度為1.5 mol/L的PCA，冰浴 10 min，4℃下 10 000×g離心 10 min.吸取上清液，260 nm處測定RNA的吸光度值.沉淀中加入1 mL濃度為 0.2 mol/L的 PCA，4℃下10 000×g離心10 min.棄去上清液，沉淀中加入1.1 mL濃度為0.6 mol/L的PCA.85℃水浴15 min，之后冰浴15 min.4℃下10 000×g離心10 min.吸取上清液，260 nm處測定DNA的吸光度.

1.3 實驗設計

除處理因素差異外，其余操作均按1.1和1.2所描述的流程進行.

1.3.1 勻漿介質的比較

選取2種勻漿介質作為處理因素.Ⅰ號勻漿介質：濃度為0.05 mol/L的Tris-HCl+濃度為0.050 mol/L的EDTA.（pH 7.4）；Ⅱ號勻漿介質：濃度為0.05 mol/L的 Tris-HCl+濃度為 0.005 mol/L 的 EDTA（pH 7.4）.每個處理做3個重復.

1.3.2 離心速率的比較

選取4種離心速率作為處理因素，分別為3 000×g，6 000×g，10 000×g，12 000×g.每個處理做 2個重復.

1.3.3 堿解水浴時間的比較

選取2種37℃堿解水浴時間作為處理因素，分別為水浴1h和水浴2h.每個處理做3個重復.

1.3.4 堿解量的比較

選取2種堿解量作為處理因素，處理Ⅰ為0.56 mL濃度為0.3 mol/L的KOH堿解，之后用0.25 mL濃度為1.5 mol/L的PCA酸化沉淀DNA；處理Ⅱ為0.7 mL濃度為0.3 mol/L的KOH堿解，之后用0.35 mL濃度為1.5 mol/L的PCA酸化沉淀DNA.每個處理做3個重復.

1.4 核酸含量及RNA和DNA含量比值的計算

CRNA=A260nm（RNA）/0.03，CDNA=A260nm（DNA）/0.03式中：CRNA為RNA含量，CDNA為DNA含量，單位均為μg/mL；A260nm是指在260 nm處測得的吸光度值.計算核酸含量時核苷酸的消光系數為0.03[11].

1.5 數據分析

所有分析均使用統計軟件STATISTICA（version6.0）進行.使用成組數據t檢驗分析比較勻漿介質、37℃堿解水浴時間和堿解量3個實驗得到的CRNA、CDNA、RNADNA含量比值.使用單因素方差分析比較4種離心速度間的差異，p＜0.05時差異具有統計學意義.計算各種差異處理的變異系數CV（CV=標準差/平均數×100%）.

2 結果與討論

2.1 勻漿介質對RNA-DNA含量比值測定的影響

分別采用2種勻漿介質處理中華鱉的肝臟組織，堿解分離后，RNA和DNA的含量以及比值情況如表1所示.

表1 不同勻漿介質處理下肝臟組織中RNA和DNA的分離結果（平均數±標準差）Tab.1 Seperating resultsof RNA and DNA of liver tissue treated with different reagent for homogenizing

t檢驗結果顯示，2種勻漿介質處理后所測得的CRNA、CDNA和RNA-DNA含量比值差異均沒有統計學意義（p＞0.05），但是Ⅱ號勻漿介質的3個變異系數均小于Ⅰ號勻漿介質，即Ⅱ號勻漿可提高中華鱉肝臟組織RNA-DNA含量比值測定的穩定性.

2.2 離心速率對RNA-DNA含量比值測定的影響

在中華鱉肝臟組織的堿解過程中，不同離心速率對CRNA、CDNA和RNA-DNA含量比值的影響如表2所示.

表2 不同離心速率下肝臟組織中RNA和DNA的分離結果Tab.2 Seperating resultsof RNA and DNA of liver tissue treated with different centrifuge speed

表2結果顯示，4種離心速率所測得的CRNA、CDNA和RNA-DNA含量比值略有差異，但差異沒有統計學意義（p＞0.05），12 000×g離心速率下 3個變異系數最小，即該離心速率能夠提高中華鱉肝臟組織RNA-DNA含量比值測定的穩定性.

露斯塔野鯪（Labeo rohita）的肌肉組織和凡納濱對蝦（Penaeus vannamei）的腹部肌肉組織RNA-DNA含量比值測定使用的離心速率是3 000×g[12-13]；歐洲大扇貝（Pecten maximus）的性腺RNA-DNA含量比值測定使用的離心速率是10 000×g[10]；大西洋鱈魚（Gadus morhua）全魚體RNA-DNA含量比值測定使用的離心速率是6 000×g[9].這些已有研究中使用不同的離心速率，可能是由于物種不同以及所取的組織不同，因此測定RNA-DNA含量比值的最佳離心速率不同.

2.3 堿解水浴時間對RNA-DNA含量比值測定的影響

考察中華鱉肝臟組織的堿解過程中，堿解水浴時間對CRNA、CDNA和RNA-DNA含量比值的影響，結果如表3所示.

表3 不同堿解水浴時間下肝臟組織中RNA和DNA的分離結果Tab.3 Seperating resultsof RNA and DNA of liver tissue treated with different time of water bath at 37℃

t檢驗結果顯示，堿解水浴時間2h的處理中，CRNA和RNA-DNA含量比值明顯大于水浴時間1h的處理，差異具有高度統計學意義（p＜0.01）；水浴時間1h處理組的CDNA大于2h處理，差異具有統計學意義（p＜0.05）.變異系數方面，水浴2h處理組中，各項變異系數均較小.

露斯塔野鯪（Labeo rohita）的肌肉組織和凡納濱對蝦（Penaeus vannamei）的腹部肌肉組織RNA-DNA含量比值測定研究中，分離RNA的堿解水浴時間是2h[12-14]；歐洲大扇貝（Pecten maximus）性腺和大西洋鱈魚（Gadusmorhua）全魚體RNA-DNA含量比值測定研究中，分離RNA的堿解水浴時間是1h[9-10].本實驗比較2種常用的堿解水浴時間，結果表明37℃堿解水浴2h能夠使中華鱉肝臟組織的RNA堿解更充分，同時能夠提高測定的穩定性和準確性.

2.4 堿解量對RNA-DNA含量比值測定的影響

不同堿解量下中華鱉肝臟組織中RNA和DNA的分離情況如表4所示.

表4 不同堿解量下肝臟組織中RNA和DNA的分離結果Tab.4 Seperating resultsof RNA and DNA of liver tissue treated with different quantity of alkaline

t檢驗結果顯示，處理Ⅰ中 CRNA、CDNA、RNA-DNA含量比值均高于處理Ⅱ，2個處理組間CRNA和RNADNA含量比值的差異具有統計學意義（p＜0.05）.由此可見，處理2加大堿解量和酸化沉淀的PCA量會降低肝臟組織CRNA以及RNA-DNA含量比值，同時各項變異系數變大.

已發表研究中[9-13，15]由于物種不同以及所取組織不同，測定RNA-DNA含量比值的最佳分離RNA沉淀DNA的堿解量和酸化的PCA量也不相同.本實驗比較2種常用的堿解量，結果表明0.56 mL濃度為0.3 mol/L的KOH+0.25 mL濃度為1.5 mol/L的PCA的堿解酸化組合能夠提高中華鱉肝臟組織RNA-DNA含量比值測定的穩定性.

3 結論

本實驗在測定中華鱉肝臟組織RNA-DNA含量過程中，對勻漿介質的組成成分、離心速率、37℃堿解水浴時間和堿解量這4項操作細節進行了優化.最終認為在堿解法基本操作流程的基礎上，使用以0.05 mol/L的Tris-HCl+濃度為 0.005 mol/L 的 EDTA（pH 7.4）作為主要成分的勻漿介質，使用12 000×g離心速率，37℃堿解水浴2h，0.56 mL濃度為0.3 mol/L的KOH+0.25 mL濃度為1.5 mol/L的PCA的堿解酸化組合，能夠提升測定中華鱉肝臟組織RNA-DNA含量比值的穩定性和準確性.

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