七氟菊酯和溴氰菊酯對(duì)棉鈴蟲神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的影響

韓麗鑫，吳廣彥，藏媛媛，賀秉軍

（南開(kāi)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，天津 300071）

擬除蟲菊酯是一類人工合成的具有神經(jīng)毒性的殺蟲劑，因其具有高效、低毒、廣譜和較好的環(huán)境兼容性等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于殺滅農(nóng)業(yè)及衛(wèi)生害蟲.擬除蟲菊酯按化學(xué)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)分為2類：Ⅰ型擬除蟲菊酯，分子中沒(méi)有 α-氰基，如七氟菊酯（tefluthrin，TM）；Ⅱ型擬除蟲菊酯，分子中有1個(gè)α-氰基，如溴氰菊酯（deltamethrin，DM）[1].

棉鈴蟲 Helicoverpaarmigera（Hübner）是對(duì)農(nóng)業(yè)危害極大的一種鱗翅目夜蛾科昆蟲，其分布及寄主范圍非常廣泛.在中國(guó)，棉鈴蟲每年給棉花一項(xiàng)經(jīng)濟(jì)作物所造成的直接經(jīng)濟(jì)損失可高達(dá)50億元.20世紀(jì)90年代初，在黃河和長(zhǎng)江流域棉區(qū)曾發(fā)生過(guò)棉鈴蟲特大災(zāi)害，造成直接經(jīng)濟(jì)損失多達(dá)百億元[2].雖然棉鈴蟲已對(duì)擬除蟲菊酯類殺蟲劑表現(xiàn)出明顯的抗藥性[3]，但鑒于開(kāi)發(fā)新藥的難度與成本巨大，擬除蟲菊酯現(xiàn)仍占世界殺蟲劑市場(chǎng)份額的20%以上，且所占份額在不斷增加[1，4].因此，在沒(méi)有新的高效安全的殺蟲劑問(wèn)世之前，如何延長(zhǎng)擬除蟲菊酯的使用壽命有非常重要的現(xiàn)實(shí)意義.這就需要先探明擬除蟲菊酯的殺蟲機(jī)理及棉鈴蟲產(chǎn)生抗藥性的原因.

自從發(fā)現(xiàn)電壓門控鈉通道（Voltage-gated sodium channels，VGSCs）不是擬除蟲菊酯唯一的作用靶標(biāo)以來(lái)，已有大量有關(guān)擬除蟲菊酯其他作用靶標(biāo)的研究報(bào)道.如有研究認(rèn)為，擬除蟲菊酯除作用于VGSCs外，還可影響電壓門控鈣通道（Voltage-gated calcium channels，VGCCs）[5-6]、電壓門控氯通道[5，7]、ATPase[7]、鉀通道[8]、GABA受體[7，9]等.還有一些研究結(jié)果表明，擬除蟲菊酯可通過(guò)某些機(jī)制影響細(xì)胞內(nèi)的Ca2+濃度.Clark等[10-11]研究發(fā)現(xiàn)，DM可通過(guò)作用于N-型VGCC（Cav2.2）來(lái)升高大鼠離體突觸內(nèi)的Ca2+濃度，且該反應(yīng)與VGSCs無(wú)關(guān)；Cao等[1]發(fā)現(xiàn)包括DM和TM在內(nèi)的9種擬除蟲菊酯都可增加原代培養(yǎng)的鼠神經(jīng)元內(nèi)的Ca2+濃度，且該反應(yīng)引起的Ca2+內(nèi)流與VGSCs有關(guān)；也有報(bào)道[12]稱蜜蜂腦神經(jīng)元上的T-型VGCC是擬除蟲菊酯的作用靶標(biāo).很多實(shí)驗(yàn)都已證明擬除蟲菊酯可增加胞內(nèi)的Ca2+濃度水平，但擬除蟲菊酯是通過(guò)何種機(jī)制引起的該反應(yīng)還沒(méi)有統(tǒng)一結(jié)論[1，10，13-14].

本研究利用激光掃描共聚焦顯微鏡技術(shù)，以棉鈴蟲神經(jīng)元為實(shí)驗(yàn)材料，探究2種擬除蟲菊酯——溴氰菊酯和七氟菊酯對(duì)神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度的影響，并進(jìn)行了機(jī)理初探，以期有助于闡明擬除蟲菊酯的殺蟲機(jī)理.

1 材料與方法

1.1 棉鈴蟲的飼養(yǎng)

本實(shí)驗(yàn)室所用棉鈴蟲購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，該種群為農(nóng)藥敏感品系，購(gòu)得的棉鈴蟲一直在本實(shí)驗(yàn)室內(nèi)人工飼養(yǎng)傳代，飼養(yǎng)方法如下：

棉鈴蟲屬變態(tài)發(fā)育，一個(gè)世代要經(jīng)歷蟲卵、幼蟲、蛹和成蟲4個(gè)階段，其中幼蟲有5～7個(gè)齡期.實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)一個(gè)世代的棉鈴蟲約需28 d.在棉鈴蟲的不同生長(zhǎng)階段，飼養(yǎng)方法有所不同.棉鈴蟲蟲卵孵化成幼蟲后，將其轉(zhuǎn)移至預(yù)先放有小塊飼料的玻璃皿中，保鮮膜封口，并留有通氣孔.幼蟲在生長(zhǎng)期間，應(yīng)及時(shí)更新飼料.3齡幼蟲可用于實(shí)驗(yàn).為避免大齡幼蟲之間相互撕咬，保種用幼蟲（4齡及以上）轉(zhuǎn)移至6孔細(xì)胞培養(yǎng)皿中繼續(xù)飼養(yǎng)待其化蛹.棉鈴蟲的蛹放入飼養(yǎng)籠中待其羽化成成蟲后交配產(chǎn)卵，期間在籠中放置糖水供成蟲食用，并保持周圍環(huán)境適宜的濕度.飼養(yǎng)籠頂部罩有濕潤(rùn)紗布，雌蛾交配后一般在其上產(chǎn)卵，1～2 d更換1次紗布.換下的紗布放入玻璃缸中，待蟲卵孵化進(jìn)入下一個(gè)世代周期.

棉鈴蟲飼養(yǎng)室內(nèi)溫度一般保持在25～28℃，相對(duì)濕度為70%左右，適當(dāng)通風(fēng).光照時(shí)間可同外界環(huán)境，但幼蟲化蛹期間應(yīng)減少光照.棉鈴蟲的整個(gè)飼養(yǎng)過(guò)程都要防止其接觸到各類殺蟲劑，同時(shí)應(yīng)注意避免致病細(xì)菌、病毒等感染蟲體，做好培養(yǎng)皿、鑷子等工具及養(yǎng)蟲室的消毒滅菌工作.

1.2 棉鈴蟲神經(jīng)細(xì)胞的急性分離

將經(jīng)過(guò)12h饑餓處理的棉鈴蟲幼蟲（3～4齡）浸泡在體積分?jǐn)?shù)為75%的酒精中消毒3次，與此同時(shí)幼蟲被酒精麻醉.消毒后的幼蟲用生理溶液（100 mmol/L的 NaCl，4 mmol/L 的 KCl，2 mmol/L 的 CaCl2，1 mmol/L的 MgCl2，5 mmol/L 的葡萄糖，130 mmol/L 的 D-甘露醇，10 mmol/L 的 Hepes，pH7.0）沖洗體表.將幼蟲置于自制解剖盤上，背面朝上.用固定針壓住蟲體頭部的一側(cè)固定.在靠近尾端一側(cè)的體壁上剪一橫向切口，再沿蟲體縱向剪開(kāi)其背部體壁，暴露出消化道.環(huán)切蟲體肛門前體壁，使肛門連同消化道與體壁分離（注意不能剪破消化道，以免腸道細(xì)菌污染）.將肛門與消化道向前放置，隨后立即在蟲體腹部的體壁內(nèi)側(cè)滴加生理溶液，可見(jiàn)有一串黃色呈念珠狀排列的腹神經(jīng)索位于體壁上，將其取出并轉(zhuǎn)移至生理溶液中.解剖針劃開(kāi)每個(gè)神經(jīng)節(jié)外周的神經(jīng)鞘，轉(zhuǎn)移至消化酶液（Ⅰ型膠原酶液：由不含Ca2+、Mg2+的生理溶液和1 mg/mL的Ⅰ型膠原酶配制而成，pH7.0；中性酶液：由不含Ca2+、Mg2+的生理溶液和4 mg/mL的中性蛋白酶配制而成，pH7.0.將這2種酶液1∶1混合，現(xiàn)用現(xiàn)配）中酶解6～7 min.將消化后的神經(jīng)索轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)皿的培養(yǎng)基（0.7mg/mL的葡萄糖，0.4mg/mL的D-果糖，0.06mg/mL的琥珀酸，0.06 mg/mL的咪唑，13.7 mg/mL的L-15 Leibovitz培養(yǎng)基，2.8 mg/mL 的 TC-yeastolate，2.8 mg/mL的水解乳蛋白，2.383 mg/mL的Hepes，體積分?jǐn)?shù)10%～15%的胎牛血清）中，終止酶解，并用細(xì)口徑的玻璃吹打管吹打神經(jīng)索，使神經(jīng)細(xì)胞脫落分離.分離的神經(jīng)細(xì)胞置于共聚焦專業(yè)培養(yǎng)皿（中央玻片直徑15 mm）中，27℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，至少培養(yǎng)3h貼壁，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn).

1.3 激光共聚焦檢測(cè)神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的游離鈣離子濃度

實(shí)驗(yàn)前，用常規(guī)倒置顯微鏡檢查細(xì)胞狀態(tài)及其貼壁情況.熒光染料負(fù)載時(shí)，棄去原培養(yǎng)基，使用熒光測(cè)鈣含 Ca2+外液（145 mmol/L 的 NaCl，5.8 mmol/L 的KCl，2 mmol/L 的 CaCl2，1 mmol/L 的 MgCl2，5.5 mmol/L 的葡萄糖，10 mmol/L 的 Hepes，10 mmol/L 的蔗糖，pH6.9）漂洗細(xì)胞1次.加入5μmol/L的Fluo-3/AM熒光染料溶液（用熒光測(cè)鈣含Ca2+外液配制，現(xiàn)配現(xiàn)用）100μL，27℃避光孵育30～60 min.負(fù)載后，棄去Fluo-3/AM，用熒光測(cè)鈣含Ca2+外液再次漂洗細(xì)胞2～3次.最后，在共聚焦專業(yè)皿中加入900μL熒光測(cè)鈣含Ca2+外液，27℃培養(yǎng)箱中避光孵育20 min以確保染料在細(xì)胞內(nèi)完全去酯化，上機(jī)檢測(cè).對(duì)于細(xì)胞外液無(wú)Ca2+組，將實(shí)驗(yàn)中染料負(fù)載結(jié)束后漂洗所用的熒光測(cè)鈣含Ca2+外液及最后加入的900μL外液同時(shí)替換成無(wú)鈣外液（2 mmol/L的CaCl2替換成5 mmol/L的EGTA，同時(shí)為保證合適滲透壓，不添加蔗糖，其他成分保持不變）即可.對(duì)于河豚毒素（tetrodotoxin，TTX，電壓門控鈉通道阻斷劑）干預(yù)組，神經(jīng)細(xì)胞負(fù)載完熒光染料并用外液漂洗后，加入含有5μmol/L的TTX熒光測(cè)鈣含Ca2+外液，避光孵育10 min后上機(jī)檢測(cè).

將負(fù)載好的細(xì)胞置于激光掃描共聚焦顯微鏡的載物臺(tái)上，用顯微鏡選擇貼壁、負(fù)載良好且分布相對(duì)集中的細(xì)胞.設(shè)置掃描各項(xiàng)參數(shù)：信號(hào)采集頻率為3 s/幅；掃描時(shí)間共10 min.在掃描1～2 min獲得神經(jīng)細(xì)胞未受刺激時(shí)的熒光基線水平后，加入一定量的DM（Aladdin，分析標(biāo)準(zhǔn)品）或 TM（Sigma，純度 96.4%），繼續(xù)實(shí)時(shí)觀測(cè)藥物施加后的細(xì)胞熒光變化情況.實(shí)驗(yàn)中所用藥物（DM或TM）溶解于二甲基亞砜（DMSO）中，并在實(shí)驗(yàn)前用熒光測(cè)鈣含鈣離子/無(wú)鈣離子外液配制成一定濃度使用.DMSO總體積分?jǐn)?shù)在1‰以內(nèi).

所測(cè)得的細(xì)胞熒光強(qiáng)度反映了胞內(nèi)的Ca2+濃度水平.細(xì)胞熒光強(qiáng)度變化以實(shí)時(shí)熒光值F與初始熒光值（即加藥之前獲得的熒光基線）的均值F0的比值（F/F0）來(lái)表示.

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所得數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 20（IBM）軟件進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA），以p＜0.05為標(biāo)準(zhǔn)，表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并用“*”標(biāo)注.

2 結(jié)果與分析

2.1 溴氰菊酯和七氟菊酯對(duì)棉鈴蟲神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的影響

共聚焦顯微鏡下，連續(xù)動(dòng)態(tài)記錄細(xì)胞的熒光強(qiáng)度（用F/F0表示）變化即可反映出該細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的實(shí)時(shí)變化情況.在記錄到細(xì)胞的基礎(chǔ)熒光水平后，用終濃度為10μmol/L的DM和TM分別刺激棉鈴蟲的神經(jīng)細(xì)胞，結(jié)果如圖1所示.當(dāng)細(xì)胞外液中存在Ca2+時(shí)，DM或TM分別刺激后，神經(jīng)細(xì)胞的熒光強(qiáng)度明顯增加，且升高到一定水平后，基本維持在高水平處，如圖1（a）和圖1（b）所示；對(duì)照組熒光強(qiáng)度無(wú)明顯變化，如圖1（c）所示.

圖1 DM和TM刺激下棉鈴蟲神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)Ca2+的熒光強(qiáng)度（細(xì)胞外液中存在Ca2+）Fig.1 Fluorescence intensity of Ca2+in central neuronsofh.arm igera exposed to DM and TM(with Ca2+in extracellular solution)

鑒于細(xì)胞內(nèi)Ca2+的熒光強(qiáng)度波動(dòng)較大，采用加藥后第5分鐘內(nèi)的Ca2+熒光強(qiáng)度的平均水平進(jìn)行各組數(shù)據(jù)的比較分析，如圖2所示.

圖2 DM和TM刺激第5分鐘內(nèi)棉鈴蟲神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)Ca2+的平均熒光強(qiáng)度（細(xì)胞外液中存在Ca2+）Fig.2 Average fluorescence intensity of Ca2+in central neuronsofh.armigera exposed to DM and TM in the fifth Minute(with Ca2+in extracellular solution)

2.2 溴氰菊酯和七氟菊酯影響神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的作用機(jī)理

細(xì)胞外液中無(wú)Ca2+時(shí)，用10μmol/L的DM或TM分別刺激棉鈴蟲神經(jīng)細(xì)胞.共聚焦顯微鏡下記錄到的細(xì)胞熒光強(qiáng)度無(wú)明顯變化，測(cè)試時(shí)間（10 min）內(nèi)一直在熒光基線水平上下波動(dòng)，如圖3所示.

圖3 DM和TM刺激下棉鈴蟲神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)Ca2+的熒光強(qiáng)度（細(xì)胞外液中不存在Ca2+）Fig.3 Fluorescence intensity of Ca2+in central neuronsofh.armigera exposed to DM and TM(w ithout Ca2+in extracellular solution)

神經(jīng)細(xì)胞用濃度為5μmol/L的TTX孵育10 min后上機(jī)檢測(cè)，結(jié)果如圖4所示.DM和TM都不能再使棉鈴蟲神經(jīng)細(xì)胞的熒光強(qiáng)度升高.在測(cè)試時(shí)間（10 min）內(nèi)，細(xì)胞的熒光強(qiáng)度一直在熒光基線水平上下波動(dòng).

采用加藥后第5分鐘內(nèi)的Ca2+熒光強(qiáng)度的平均值進(jìn)行各組數(shù)據(jù)的比較分析，如圖5所示.

圖5 TTX孵育后DM和TM刺激第5分鐘內(nèi)棉鈴蟲神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)Ca2+的平均熒光強(qiáng)度（細(xì)胞外液中存在Ca2+）Fig.5 Average fluorescence intensity of Ca2+in central neurons ofh.arm igera exposed to DM and TM in the fifth Minute(incubated with TTX and with Ca2+in extracellular solution)

由圖5可以看出，DM和TM都可以刺激棉鈴蟲神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的Ca2+濃度升高，但該反應(yīng)只有在細(xì)胞外液中存在Ca2+時(shí)才會(huì)發(fā)生.而當(dāng)細(xì)胞外液中無(wú)游離Ca2+存在時(shí)，神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的Ca2+濃度水平在DM或TM刺激前后無(wú)明顯變化，加藥后第5分鐘內(nèi)的胞內(nèi)平均Ca2+濃度水平與對(duì)照組相比，二者之間的差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p>0.05）.該結(jié)果表明，DM和TM都可以升高胞內(nèi)Ca2+濃度，但這一反應(yīng)與胞內(nèi)鈣庫(kù)無(wú)關(guān).用TTX預(yù)處理神經(jīng)細(xì)胞后，即使細(xì)胞外液中存在游離Ca2+，DM或TM都沒(méi)有再改變胞內(nèi)的Ca2+濃度水平.這說(shuō)明DM或TM對(duì)胞內(nèi)Ca2+濃度的影響很可能與細(xì)胞膜上的VGSCs相關(guān).

3 討論

目前，“VGSCs是擬除蟲菊酯的主要作用靶標(biāo)”這一結(jié)論已獲得廣泛共識(shí)[9，15]，而隨后研究發(fā)現(xiàn)的擬除蟲菊酯的其他作用靶標(biāo)，有些可能并不是擬除蟲菊酯殺蟲的主要原因，但也許有助于增強(qiáng)擬除蟲菊酯的毒性[16].目前，已有大量報(bào)道稱擬除蟲菊酯可以影響胞內(nèi)的Ca2+濃度，但對(duì)于擬除蟲菊酯通過(guò)何種途徑影響胞內(nèi)Ca2+濃度目前仍存在爭(zhēng)議[1，10，13-14].

Clark等[10-11]發(fā)現(xiàn)DM是通過(guò)作用于N-型VGCC（Cav2.2）來(lái)升高突觸內(nèi)的Ca2+濃度，且DM對(duì)N-型VGCC的這種修飾作用與VGSCs無(wú)關(guān).然而Hildebrand等[7]發(fā)現(xiàn)丙烯菊酯（allethrin）對(duì)在HEK293細(xì)胞中異源表達(dá)的哺乳動(dòng)物的 L-型（Cav1.2）、T-型（Cav3.1）和 P/Q-型（Cav2.1）VGCCs有抑制而非激活作用.Neal等[17]發(fā)現(xiàn)丙烯菊酯可刺激已分化的PC12細(xì)胞的Ca2+電流增加，且該反應(yīng)不受TTX影響，針對(duì)VGCCs的不同亞型丙烯菊酯的作用也不相同，對(duì)PC12細(xì)胞的N-型VGCC有抑制作用，卻可激活L-型VGCC.該結(jié)果與DM作用于異源表達(dá)在卵母細(xì)胞上的Cav2.2得到的結(jié)果[13]有所不同.

值得注意的是，上述研究結(jié)果多來(lái)自于哺乳動(dòng)物的離體突觸體或異源表達(dá)系統(tǒng)，它們與體內(nèi)完整的神經(jīng)細(xì)胞有一定差別，后者有胞內(nèi)的調(diào)節(jié)因子調(diào)控，同時(shí)具有自發(fā)活性，不需要外界刺激（如高濃度的K+或電壓）激活.為此，Cao等[1]以原代培養(yǎng)的鼠神經(jīng)元為實(shí)驗(yàn)材料，探究11種擬除蟲菊酯對(duì)胞內(nèi)Ca2+濃度的影響.結(jié)果發(fā)現(xiàn)9種擬除蟲菊酯（包括DM和TM）可以升高神經(jīng)元內(nèi)的Ca2+濃度，且TTX可阻斷這9種擬除蟲菊酯引起的胞外Ca2+內(nèi)流，表明Ca2+內(nèi)流與VGSCs有關(guān)，這與Clark等[11]用大鼠腦突觸體實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)論完全不同.Wu等[18]研究發(fā)現(xiàn)，TM可使大鼠垂體瘤細(xì)胞及下丘腦神經(jīng)細(xì)胞上的L-型VGCC電流幅度減小.也有報(bào)道稱T-型VGCC是擬除蟲菊酯的作用靶標(biāo)[12-13，19].

目前，對(duì)擬除蟲菊酯是否可以促使胞內(nèi)鈣庫(kù)釋放Ca2+也沒(méi)有統(tǒng)一結(jié)論.在牛玉杰[14]、楊俊[12]和Cao 等[1]的實(shí)驗(yàn)中，擬除蟲菊酯不能誘導(dǎo)胞內(nèi)鈣庫(kù)釋放Ca2+.但郭朕群等[20]和Hsu等[21]的實(shí)驗(yàn)卻表明DM可觸發(fā)鈣庫(kù)釋放Ca2+.

本研究中七氟菊酯和溴氰菊酯都可使棉鈴蟲神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的Ca2+濃度升高，說(shuō)明DM和TM可通過(guò)某種途徑使胞外Ca2+內(nèi)流和/或胞內(nèi)鈣庫(kù)釋放Ca2+，最終導(dǎo)致胞內(nèi)Ca2+增加.當(dāng)細(xì)胞外無(wú)Ca2+存在時(shí)，DM和TM對(duì)神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的Ca2+濃度無(wú)影響，表明二者是作用于細(xì)胞膜，使外鈣內(nèi)流而非內(nèi)鈣釋放，此結(jié)果與牛玉杰等[14]、楊俊等[12]用原代神經(jīng)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)所得結(jié)論一致.VGSCs是公認(rèn)的擬除蟲菊酯的作用靶標(biāo)，作用機(jī)制是擬除蟲菊酯延長(zhǎng)VGSCs的開(kāi)放時(shí)間，使細(xì)胞膜持續(xù)去極化[15]，這讓人聯(lián)想到DM和TM能使胞內(nèi)Ca2+濃度增加是否與Na+內(nèi)流有關(guān).本研究發(fā)現(xiàn)，VGSCs被TTX阻斷后，即使細(xì)胞外液中存在Ca2+，DM和TM對(duì)神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度仍無(wú)影響.這個(gè)結(jié)果與牛玉杰等[14]和Cao等[1]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符，但卻與Clark等[10-11]和Neal等[17]的結(jié)果相悖.這可能是因?yàn)閷?shí)驗(yàn)材料（原代細(xì)胞、異源表達(dá)系統(tǒng)、離體突觸體）的不同會(huì)影響擬除蟲菊酯的修飾結(jié)果，完整的原代神經(jīng)元具有自發(fā)活性，且胞內(nèi)具有調(diào)控因子對(duì)其進(jìn)行調(diào)節(jié).類似情況也曾出現(xiàn)在Clark等[10]和Symington等[22]的其他研究中：用 DM分別刺激表達(dá)在卵母細(xì)胞上的野生型Cav2.2和發(fā)生T422E突變（人為引入磷酸化，以模擬DM在體內(nèi)作用的情況）的Cav2.2得到的結(jié)果截然不同，Alves等[23]也證實(shí)了這一結(jié)論.可見(jiàn)，細(xì)胞內(nèi)的調(diào)控因子對(duì)擬除蟲菊酯的作用影響很大.因此，推測(cè)DM和TM很有可能是先作用于棉鈴蟲神經(jīng)細(xì)胞的VGSCs上，觸發(fā)Na+內(nèi)流，使細(xì)胞膜持續(xù)去極化激活VGCCs，或通過(guò)胞內(nèi)Na+超載激活反式Na+/Ca2+交換體[1]，最終導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度異常升高.這一推測(cè)仍需后續(xù)實(shí)驗(yàn)證實(shí).

4 結(jié)論

本研究利用激光掃描共聚焦顯微鏡技術(shù)，探究了七氟菊酯和溴氰菊酯對(duì)棉鈴蟲神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度影響的作用機(jī)制，初步得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果為：2種擬除蟲菊酯——七氟菊酯（Ⅰ型）和溴氰菊酯（Ⅱ型）都可升高棉鈴蟲神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的Ca2+濃度水平，該反應(yīng)與胞內(nèi)鈣庫(kù)無(wú)關(guān)，很可能是七氟菊酯或溴氰菊酯先作用于電壓門控鈉離子通道觸發(fā)Na+內(nèi)流后引發(fā)的反應(yīng).

[1]CAO Z，SHAFER T J，MURRAY T F.Mechanisms of pyrethroid insecticide-induced stimulation of calcium influx in neocortical neurons[J].Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics，2010，336（1）：197-205.

[2]楊亦樺.棉鈴蟲對(duì)擬除蟲菊酯氧化代謝抗性的生化與分子機(jī)理[D].南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2005.

[3]魏洪義，杜家緯.擬除蟲菊酯類殺蟲劑對(duì)棉鈴蟲雌蛾化學(xué)通訊系統(tǒng)的影響[J].植物保護(hù)學(xué)報(bào)，2006，33（3）：298-302.

[4]陶黎明.昆蟲抗藥性及其治理對(duì)策的研究[D].上海：中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院，2005.

[5]SODERLUNDDM，CLARK JM，SHEETSL P，et al.Mechanisms of pyrethroid neurotoxicity：implications for cumulative risk assessment[J].Toxicology，2002，171（1）：3-59.

[6]SOUNDARARAJANRP.Pesticides-Advancesin Chemicaland Botanical Pesticide[M].Croatia：InTech，2012.

[7]HILDEBRAND ME，MCRORY JE，SNUTCH T P，et al.Mammalian voltage-gated calcium channels are potently blocked by the pyrethroid insecticideallethrin[J].Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics，2003，308（3）：805-813.

[8]RAOGV，RAOK SJ.Modulation of K+transport across synaptosomes of rat brain by synthetic pyrethroids[J].Journal of the Neurological Sciences，1997，147（2）：127-133.

[9]HOSSAINMM，RICHARDSON JR.Mechanism of pyrethroid pesticideinduced apoptosis：role of calpain and the ER stress pathway[J].Toxicological Sciences，2011，122（2）：512-525.

[10]CLARK JM，SYMINGTONSB.Pyrethroid action on calcium channels：neurotoxicological implications[J].Invertebrate Neuroscience，2007，7（1）：3-16.

[11]CLARK JM，SYMINGTONSB.Neurotoxic implicationsof theagonistic actionof CS-syndromepyrethroidson theN-typeCav2.2calciumchannel[J].Pest Management Science，2008，64（6）：628-638.

[12]楊俊.溴氰菊酯對(duì)蜜蜂腦神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)鈣離子影響的研究及機(jī)理初探[D].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2012.

[13]SYMINGTON S B，CLARK J M.Action of deltamethrin on N-type（Cav2.2）voltage-sensitive calcium channels in rat brain[J].Pesticide Biochemistry and Physiology，2005，82（1）：1-15.

[14]牛玉杰，石年，李龍，等.溴氰菊酯對(duì)大鼠神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)游離鈣的影響[J].衛(wèi)生毒理學(xué)雜志，2001，15（4）：216-218.

[15]NARAHASHI T.Neuronal ion channels as the target sites of insecticides[J].Pharmacology and Toxicology，1996，79（1）：1-14.

[16]BRECKENRIDGECB，HOLDEN L，STURGESSN，etal.Evidence for aseparatemechanismoftoxicityfortheTypeⅠand theTypeⅡpyrethroid insecticides[J].Neuro Toxicology，2009，30（Suppl）：17-31.

[17]NEAL AP，YUANY，ATCHISONWD.Allethrindifferentially modulates voltage-gated calcium channel subtypes in rat PC12 cells[J].Toxicological Sciences，2010，116（2）：604-613.

[18]WUSN，WUYh，CHENBS，et al.Underlyingmechanism of actions of tefluthrin，a pyrethroid insecticide，on voltage-gated ion currents andonaction currentsinpituitary tumor（GH3）cellsand GnRH-secreting（GT1-7）neurons[J].Toxicology，2009，258（1）：70-77.

[19]SHAFER T J，MEYERD A.Effects of pyrethroidson voltage-sensitive calcium channels：a critical evaluation of strengths，weaknesses，data needs，and relationship to assessment of cumulative neurotoxicity[J].Toxicology and Applied Pharmacology，2004，196（2）：303-318.

[20]郭朕群，賀秉軍，高永闖，等.溴氰菊酯對(duì)神經(jīng)細(xì)胞鈣通道和鈣庫(kù)的激活作用[J].昆蟲學(xué)報(bào)，2000，43（3）：248-254.

[21]HSUSS，CHOUCT，LIAOW C，et al.Deltamethrin-induced[Ca2+]i rise and death in HGB human glioblastoma cells[J].Chinese Journal of Physiology，2012，55（4）：294-304.

[22]SYMINGTONSB，F(xiàn)RISBIERK，KIMH J，etal.Mutation of threonine 422 toglutamic acid mimicsthephosphorylationstateand alterstheaction of deltamethrin on Cav2.2[J].Pesticide Biochemistry and Physiology，2007，88（3）：312-320.

[23]ALVES A M，SYMINGTON SB，LEE Sh，et al.PKC-dependent phosphorylations modify the action of deltamethrin on rat brain N-type（Cav2.2）voltage-sensitive calcium channel[J].Pesticide Biochemistry and Physiology，2010，97（2）：101-108.