白僵菌不同菌株對(duì)美國白蛾幼蟲的致病力及田間應(yīng)用研究

白鵬華，白義川，馮友仁，劉寶生

（天津市植物保護(hù)研究所，天津300381）

重大植物檢疫害蟲—美國白蛾（Hyphantria curea Drury）屬鱗翅目（Lepidoptera）燈蛾科（Arctiidae），是一種多食性的檢驗(yàn)檢疫害蟲，可危害636種植物，在中國的寄主植物有300多種[1-2].美國白蛾于1979年入侵中國，目前在遼寧、天津、山東、河北、北京、陜西等省市均有發(fā)生，并有進(jìn)一步擴(kuò)散傳播的趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅林業(yè)生產(chǎn)和園林綠化.有報(bào)道表明[3]：2004年美國白蛾的發(fā)生面積為11.7萬hm2，在全國所造成的非經(jīng)濟(jì)損失合計(jì)為140.35億元，平均為11.99萬元/hm2.目前，對(duì)美國白蛾主要是靠投入大量財(cái)力、物力進(jìn)行化學(xué)防治，雖然可以在局部地區(qū)取得一定的控制效果，但容易引起美國白蛾產(chǎn)生抗藥性，對(duì)環(huán)境污染嚴(yán)重，也大量殺傷了天敵，造成了年年防蟲、年年有災(zāi)的局面，不符合生態(tài)和可持續(xù)控制的有害生物綜合防治措施[4].因此，無公害防治美國白蛾已成為當(dāng)今研究熱點(diǎn)之一，其中以菌治蟲生防措施引起廣泛關(guān)注.

白僵菌（Beauveria bassiana）是目前世界上防治害蟲應(yīng)用較廣、被公認(rèn)為最有前途的一種蟲生真菌[5].白僵菌具有生產(chǎn)方便、成本低廉、致病力強(qiáng)、不傷害天敵、對(duì)人畜無毒害、不污染環(huán)境、可擴(kuò)散流行等優(yōu)點(diǎn)，具有非常高的生物防治價(jià)值[6].國外研究表明，白僵菌與青蒿和薰衣草提取物聯(lián)合防治不同寄主的美國白蛾效果顯著[7]；劉寶生等[8]研究發(fā)現(xiàn)球孢白僵菌對(duì)美國白蛾1齡幼蟲具有較強(qiáng)的致病力；劉永清等[9]研究表明白僵菌菌株對(duì)美國白蛾5齡幼蟲有較高的侵染效果；李龍等[10]采用飼喂、口服、表皮接觸和血腔注射4種生測(cè)方法測(cè)定白僵菌代謝提取物對(duì)美國白蛾幼蟲的毒性，結(jié)果表明血腔注射所表現(xiàn)出的毒性最高.本研究選用不同來源的11株球孢白僵菌（Beauveria bassiana）菌株，以室內(nèi)生測(cè)法研究其對(duì)美國白蛾幼蟲的毒力，為美國白蛾的生物防治提供科學(xué)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 供試蟲源與白僵菌分生孢子粉

供試各白僵菌菌株經(jīng)預(yù)先活化后接種于沙氏平板培養(yǎng)基上，恒溫25℃下培養(yǎng)14 d.

1.2 供試菌種

對(duì)獲得的11個(gè)白僵菌菌種進(jìn)行分離、培養(yǎng)，具體菌株代號(hào)與來源如表1所示.

表1 11株白僵菌菌種來源Tab.1 Origin of 11 strains of B.bassiana studied

通過形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法鑒定11個(gè)菌種均為球孢白僵菌[11]，保存于天津市植物保護(hù)研究所林業(yè)病蟲害研究室.

1.3 白僵菌菌株對(duì)美國白蛾幼蟲致病力和毒力測(cè)定方法

1.3.1 致病力測(cè)定

本研究采用定量涂抹法制成含白僵菌的法桐葉片，飼喂美國白蛾幼蟲.首先配制11個(gè)白僵菌菌株的孢子懸浮液母液，測(cè)量孢子含量后，再稀釋成1×108mL-1溶液.將法桐葉片洗凈，置室內(nèi)晾曬，待表面水分晾干后，剪成直徑90 mm的圓形.每張葉片涂抹350μL的孢子懸浮液，以涂抹質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05%的吐溫80滅菌水為空白對(duì)照處理.含菌葉片經(jīng)室內(nèi)晾曬，表面水分晾干后備用.

各處理培養(yǎng)皿內(nèi)墊4層面巾紙，加足無菌水并控出多余水分.將含菌葉片移入培養(yǎng)皿，每皿1張，每處理重復(fù)3次（即3個(gè)培養(yǎng)皿）.每個(gè)培養(yǎng)皿接蟲20頭.培養(yǎng)皿接蟲后，皿蓋與皿底間用面巾紙密封，防止幼蟲逃逸.將所有處理培養(yǎng)皿置于25℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，在濕度80%～90%下飼養(yǎng)，適時(shí)更換帶毒葉片.

觀測(cè)96、120和144h時(shí)各處理的活蟲和死蟲數(shù)量，計(jì)算各處理下的校正死亡率.

校正死亡率（%）=[（處理組死亡率-對(duì)照組死亡率）/（1-對(duì)照死亡率）]×100[6]

4.1.3 單位面積收益變化。分析圖5-3數(shù)據(jù)可以看出，品牌膠州大白菜的經(jīng)濟(jì)效益也大幅提高——每畝大白菜收入從品牌發(fā)展階段初期2009年的9620.80元增至2016年的12500.93元。品牌膠州大白菜的收益遠(yuǎn)高于全國平均水平，且差距不斷拉大，由2009年高于全國9469.33元拉大到11545.08元，膠州大白菜種植戶生活水平得到提高。

1.3.2 高致病菌株的毒力測(cè)定

經(jīng)過室內(nèi)致病性的測(cè)定后，篩選出4株高致病白僵菌.預(yù)先配制這些菌株的孢子懸浮液母液，測(cè)量孢子含量后，稀釋成 1×108、1×107、1×106、1×105和 1×104mL-15個(gè)處理劑量，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05%的吐溫80滅菌水為空白對(duì)照組，計(jì)算4株高致病白僵菌的毒力回歸方程.含菌葉片的制備方法和飼喂美國白蛾幼蟲的方法同1.3.1.毒力測(cè)定中所有處理的幼蟲基數(shù)均為60頭，觀測(cè) 24、48、72、96、120 和 144h 時(shí)各處理下的活蟲、死蟲和白僵蟲的數(shù)量，計(jì)算各處理組的校正死亡率.

以美國白蛾幼蟲第5天的校正死亡率為50%的白僵菌濃度來計(jì)算4株白僵菌對(duì)美國白蛾幼蟲的半致死濃度（LC50）.以菌株孢子懸浮液濃度1×108mL-1使校正死亡率為50%的時(shí)間來計(jì)算半致死時(shí)間（LT50）.

1.4 田間防治實(shí)驗(yàn)

分別將球孢白僵菌菌株 Bb10331、Bb7725、Bb7716和Bb87303的孢子粉配制成濃度為1×108mL-1的懸浮液.實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)位于天津市西青區(qū)（117.00°E，39.13°N），實(shí)驗(yàn)樹木為2年生的歐美速生楊108，樹高2.5～3.0 m，株行距為2 m×2 m.2011年8月2日，選擇4個(gè)區(qū)進(jìn)行噴施，每小區(qū)3株樹，小區(qū)間設(shè)保護(hù)行，以清水為對(duì)照組.將幼蟲接到楊樹林地套好尼龍網(wǎng)袋的枝條葉片上，噴藥前調(diào)查每個(gè)尼龍網(wǎng)袋內(nèi)的活蟲數(shù)量，以此為基數(shù)，待穩(wěn)定取食24h后噴藥，在噴藥后的第2、7和10天調(diào)查蟲口數(shù)量.

防除效果（%）=[1-空白對(duì)照區(qū)的藥前蟲數(shù)×藥劑處理區(qū)藥后蟲數(shù)/（空白對(duì)照區(qū)藥后蟲數(shù)×藥劑處理區(qū)藥前蟲數(shù)）]×100[12]

1.5 數(shù)據(jù)分析

利用Excel計(jì)算校正死亡率，DPS軟件計(jì)算毒力回歸方程的a和b值、LC50和LT50、相關(guān)系數(shù)r和95%置信區(qū)間值.

2 結(jié)果與分析

2.1 11株白僵菌對(duì)美國白蛾幼蟲的致病力

本研究用11個(gè)菌株作用于美國白蛾幼蟲，室內(nèi)致病力結(jié)果如表2所示.

表2 不同白僵菌菌株作用下美國白蛾幼蟲的校正死亡率Tab.2 Corrected mortality of larvae ofh.curea treated with different strains of B.bassiana %

由表2可以看出，隨著白僵菌作用時(shí)間的延長，美國白蛾幼蟲的校正死亡率增大.11個(gè)菌株中，Bb7725作用下的校正死亡率最大，除了96h時(shí)與Bb10331差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外（p＞0.05），其他時(shí)間均顯著高于另外的10個(gè)菌株，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.05）.致病力較強(qiáng)的菌株還有 Bb0331、Bb87303和Bb7716，3個(gè)菌株之間的差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＞0.05），致病力略低于Bb7725，但顯著高于其他的7個(gè)菌株.

2.2 4株高致病性球孢白僵菌的毒力測(cè)定

從11個(gè)球孢白僵菌菌株中篩選出4個(gè)高致病性菌株，毒力測(cè)定結(jié)果如表3和表4所示.

表3 4株高致病性球孢白僵菌對(duì)美國白蛾幼蟲的LC50Tab.3 LC50 of four strainsof B.bassiana againsth.curea

表4 4株高致病性球孢白僵菌對(duì)美國白蛾幼蟲的LT50Tab.4 LT50 of four strains of B.bassiana againsth.curea

毒力測(cè)定結(jié)果中，LC50值和LT50值越小，表明球孢白僵菌菌株對(duì)美國白蛾幼蟲的毒力越強(qiáng).由表3和表4可以看出，菌株Bb7725的LC50值和LT50值最小，即毒力最強(qiáng)；其次是菌株Bb10331；4個(gè)菌株中，Bb7716的毒力最低.

2.3 4株白僵菌對(duì)美國白蛾幼蟲的田間控害效能

4株高致病性球孢白僵菌菌株在孢子懸浮液濃度為1×108mL-1時(shí)，對(duì)美國白蛾幼蟲的田間防治效果如表5所示.

表5 高致病性球孢白僵菌菌株對(duì)美國白蛾田間的防除效果Tab.5 Controlling effect of highly infecting B.bassiana againsth.curea in field %

由表5可以看出，田間實(shí)驗(yàn)條件下，4株高致病性球孢白僵菌作用于美國白蛾幼蟲后，第2天的防除效果較低，說明白僵菌對(duì)美國白蛾幼蟲防治的速效性差.隨著作用時(shí)間的延長，到了第7天，防除效果增加了近10倍，時(shí)間繼續(xù)延長，美國白蛾幼蟲的死蟲數(shù)量略有增加，但與第7天的防除效果之間的差異較小.比較4個(gè)菌株，依然是Bb7725的防除效果顯著高于其他3個(gè)菌株，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.05）；其次是菌株Bb10331；Bb87303的防除效果最差.

3 討論與結(jié)論

本研究以不同來源的11株球孢白僵菌飼毒培養(yǎng)美國白蛾低齡幼蟲，篩選出4株高致病性的菌株，分別為 Bb7725、Bb10331、Bb87303 和 Bb7716，美國白蛾幼蟲在144h后的累計(jì)校正死亡率均超過90%.對(duì)4個(gè)菌株進(jìn)行毒力測(cè)定，從致死劑量效應(yīng)來看，4個(gè)菌株孢子的 LC50值為 3.28×106～6.42×106mL-1，這與王西南等[13]的研究結(jié)果相似，高于劉永清等[9]的研究結(jié)果.從致死時(shí)間效應(yīng)來看，在孢子懸浮液濃度為1×108mL-1時(shí)，4個(gè)菌株孢子的LT50為71.13～94.36h，與白僵菌對(duì)西花薊馬的LT50值相近[14-15].從4個(gè)菌株田間防控實(shí)驗(yàn)的效能來看，在藥后7～10 d，4個(gè)菌株均表現(xiàn)出較強(qiáng)的侵染致病力（74.40%～87.29%），且Bb7725和Bb10331菌株的防除效果在藥后10 d均超過85%.田間控害效能綜合反映了菌株的毒力、菌株對(duì)環(huán)境條件的適應(yīng)性以及寄主抵御菌株的抗性能力.Bb7725、Bb10331、Bb87303和Bb7716等4個(gè)菌株對(duì)美國白蛾幼蟲的防治效果顯著，尤其是Bb7725，具有開發(fā)生防菌的潛力.

研究發(fā)現(xiàn)白僵菌不同的寄主來源及不同的溫、濕度環(huán)境均能夠影響其致病性[16-19].因此，針對(duì)不同白僵菌菌株對(duì)美國白蛾致病力的差異仍需繼續(xù)探討，以期通過環(huán)境改善及基因改造技術(shù)獲得毒力強(qiáng)、高穩(wěn)定性的白僵菌菌株.

[1]COULSONR，WITTERJ.Forestentomology：ecologyandmanagement[M].New York：John Wiley&SonsInc，1984：32-36.

[2]楊寶山，王惠，趙強(qiáng)，等.濟(jì)南市城市綠化樹種中美國白蛾寄主調(diào)查[J].濟(jì)南大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2010，24（3）：282-284.

[3]趙鐵珍，高嵐，柯水發(fā).2004年全國美國白蛾疫區(qū)的非經(jīng)濟(jì)損失評(píng)估[J].林業(yè)經(jīng)濟(jì)問題，2006，26（4）：321-326.

[4]楊忠岐，張永安.重大外來入侵害蟲——美國白蛾生物防治技術(shù)研究[J].昆蟲知識(shí)，2007，44（4）：465-471.

[5]顧麗嬙，李春香，張淑紅.球孢白僵菌和布氏白僵菌對(duì)甜菜夜蛾的室內(nèi)毒力測(cè)定[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009（3）：118-120.

[6]汪敏捷，雷玲，王建華，等.不同溫濕度下白僵菌對(duì)紅緣天牛幼蟲致病力的研究[J].天津師范大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2013，33（3）：79-82.

[7]ZIBAEE I，BANDANIA，SENDIJ.Pathogenicityof Beauveriabassiana to fall webworm（Hyphantriacunea）（Lepidoptera：Arctiidae）ondifferent host plants[J].Plant Protection Science，2013，49（4）：169-176.

[8]劉寶生，谷希樹，許靜楊，等.白僵菌Bb08-12菌株生物學(xué)研究及其對(duì)美國白蛾的致病性[J].植物保護(hù)，2011，37（4）：146-149.

[9]劉永清，畢擁國，牛亞燕，等.美國白蛾高致病性白僵菌的篩選及田間應(yīng)用[J].河北林果研究，2013，28（2）：157-160.

[10]李龍，李建慶.白僵菌代謝提取物對(duì)美國白蛾毒性生測(cè)方法的研究[J].山東林業(yè)科技，2009（6）：29-31.

[11]劉寶生，谷希樹，田濤，等.10株白僵菌菌株形態(tài)學(xué)與分子鑒定[J].山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，44（6）：93-96.

[12]柴寶山，彭永武，李慧超，等.氯蟲酰胺的合成與殺蟲活性[J].農(nóng)藥，2009，48（1）：13-16.

[13]王西南，李憲臣，李洪敬，等.球孢白僵菌WP對(duì)美國白蛾的毒力測(cè)定[J].山東林業(yè)科技，2012（2）：73-74.

[14]陳斌，張琦，桂富榮，等.球孢白僵菌不同分離株對(duì)西花薊馬的毒力測(cè)定[J].生物安全學(xué)報(bào)，2012，21（1）：14-19.

[15]SHIGEYUKIM，HIROKAZU T，TAKAFUMII.Influence of humidity on the infection of western flower thrips，F(xiàn)rankliniella occidentalis（Thysanoptera：Thripidae），by Beauveriabassiana[J].Applied Entomology and Zoology，2011，46（2）：255-264.

[16]單樂天，馮明光.不同寄主及地理來源的16株綠僵菌對(duì)桃蚜的毒力比較[J].微生物學(xué)報(bào)，2006，46（4）：602-607.

[17]張素華，雷仲仁，范淑英，等.不同溫度下4株白僵菌對(duì)西花薊馬的致病力[J].植物保護(hù)，2009，35（6）：64-67.

[18]童文鋼.白僵菌和綠僵菌不同菌株對(duì)橙斑白條天牛幼蟲的致病力[J].福建林學(xué)院學(xué)報(bào)，2012，32（3）：263-267.

[19]雷玲，汪敏捷，王建華，等.不同溫濕度下白僵菌對(duì)2種溝眶象成蟲的致病力研究[J].天津師范大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2013，33（2）：70-73.