敵百蟲對蚯蚓體內幾種解毒酶活性的影響

李 冰 ，白桂芬，謝 艷

（內蒙古赤峰學院生命科學學院，內蒙古赤峰024000）

蚯蚓是土壤生態系統的一個組成部分，在食物鏈中是土壤生物與陸地生物之間傳遞的橋梁[1].由于蚯蚓具有獨特的生物學作用，已被用于監測和指示土壤污染、評價外源污染物對土壤生態環境安全性的影響等方面[2].敵百蟲是內蒙古赤峰市區蔬菜大棚經常使用的廣譜有機磷殺蟲劑.目前敵百蟲作用于哺乳動物、魚類和昆蟲等動物的研究較多[3-8]，也有關于重金屬對蚯蚓影響的研究[2]，但敵百蟲對蚯蚓體內解毒酶活性影響的報道尚未發現.

自然界中的各種生物為避免受到內源性或外源性化學物質刺激，在進化過程中形成了一系列的代謝解毒酶系統[9].谷胱甘肽轉移酶（GSTs）是其中最重要的酶系之一，它可清除生物體內的脂類過氧化物，催化谷胱甘肽（GSH）與親電性中間代謝物結合，使之成為水溶性化合物排出體外，起到解毒作用，在植物、無脊椎動物和脊椎動物對重金屬、殺蟲劑以及除草劑等異源物質的解毒代謝中具有重要作用.在以蚯蚓作為指示動物的毒理學研究中，GSTs活性的誘導作用也常被作為指示重金屬和殺蟲劑污染的潛在分子標志物[10].乙酰膽堿酯酶（AChE）在蚯蚓的神經傳遞過程中起著重要作用，此酶主要用于評價有機磷農藥和氨基甲酸酯類農藥對蚯蚓的毒性情況.它廣泛存在于動物組織中，能夠特異性催化乙酰膽堿水解為膽堿和乙酸，維持神經系統的正常生理功能[11].有機磷農藥能夠作用于神經突觸中的AChE，導致神經傳導功能的紊亂[12].羧酸酯酶（CarE）是昆蟲體內重要的解毒酶系[13]，也是蚯蚓體內重要的解毒酶之一.

本實驗采用濾紙接觸法，研究敵百蟲對蚯蚓的生態毒理效應以及敵百蟲對蚯蚓體內的GSTs、AChE和CarE活性的影響.這一研究旨在明確敵百蟲對土壤生物的毒性效應，為敵百蟲對環境生物的影響做出早期預警，也為合理判定敵百蟲對相關動物的毒害程度積累基礎資料.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 材料

供試動物：采集赤峰市區蔬菜大棚中質量為300～500 mg、大小一致、環帶明顯的健康成蚓.

供試敵百蟲：南通江山農藥化工股份有限公司生產，生產許可證號為XK13-200-00095，農藥登記號為PD84108-5，產品標準號為GB334-2001.本研究采用質量分數為90%的敵百蟲原藥.

1.1.2 主要儀器與試劑

HC-2518小型冷凍高速離心機，由科大創新股份有限公司中佳分公司生產；ModeL680酶標儀，由BIORAD公司生產；GSTs測定試劑盒（型號：CK-E11062H）、AChE測定試劑盒（型號：CK-E10986H）、羧酸酯酶測定試劑盒（型號：CK-E11517H），均由南京建成生物工程研究所提供；磷酸二氫鈉，由沈陽市華東試劑廠生產.

1.1.3 污染物實驗質量濃度的設計

參照文獻[6]，設定敵百蟲質量濃度分別為0.02、0.03、0.04、0.05、0.06 和 0.07 g/L.

1.2 實驗方法

1.2.1 急性毒理實驗

急性毒理實驗方法參照白桂芬等[6]所做的敵百蟲單一急性毒性實驗.敵百蟲處理蚯蚓后，實驗室內常溫培育48h，觀察記錄蚯蚓的死亡情況.

1.2.2 酶源制備

參照陳東亞等[7]的方法，于相同質量濃度梯度的3個培養皿中隨機取處理后的蚯蚓2條，用蒸餾水沖洗干凈，用濾紙吸取體表多余的水分，稱重.GSTs的提取中按質量體積比1∶9加入0.1 moL/L、pH值6.5的磷酸鹽緩沖液（AChE的提取中加入1/15 moL/L、pH值8.0的磷酸鹽緩沖液；CarE的提取中加入0.2 moL/L、pH值7.0的磷酸鹽緩沖液），加入石英砂冰浴勻漿，于冷凍高速離心機中4℃、GSTs與CarE在4 000 r/min、AchE在6 500 r/min下離心15 min后，取上清液作酶源，在4℃下保存備用.

1.2.3 解毒酶標準曲線的繪制

根據3種解毒酶試劑盒的操作程序，以標準品的質量濃度為橫坐標，以對應的OD值為縱坐標繪制解毒酶的標準曲線.根據標準曲線，經Excel軟件處理后得到3種酶的線性回歸方程，分別如下：

式中：y為測得的OD值；x為酶活性；R為相關系數.

根據線性回歸方程可計算在不同敵百蟲質量濃度下3種酶的酶活性.

1.2.4 酶活性的測定

參照試劑盒測試的要求進行操作.

1.3 數據處理

采用SPSS13.0和EXCEL分析軟件對數據進行處理.

2 結果

2.1 敵百蟲對蚯蚓的急性毒理

在染毒48h后，各質量濃度敵百蟲處理下的蚯蚓中毒癥狀及其死亡率與白桂芬等[6]得到的結果基本一致.蚯蚓表現出中毒癥狀，如身體柔軟，環節較松弛，體色變深，有明顯滲血現象，并且有黃色液體滲出.部分體節腫大，生殖環糜爛.敵百蟲各質量濃度污染暴露48h對蚯蚓均產生致死效應，且蚯蚓死亡率隨著敵百蟲質量濃度的增大而升高，在實驗設定的最高質量濃度時，蚯蚓的死亡率達70%左右.

2.2 敵百蟲對蚯蚓體內酶活性的影響

在毒理實驗的基礎上研究不同質量濃度敵百蟲對蚯蚓體內解毒酶活性的影響，結果如表1所示.

表1 各質量濃度敵百蟲作用下蚯蚓體內解毒酶的活性Tab.1 Activity of detoxifying enzyme in earthworm treated with different massconcentrations of trichlorphon

2.2.1 敵百蟲對蚯蚓體內GSTs活性的影響

表1顯示，經不同質量濃度的敵百蟲染毒處理48h后，同對照組相比，蚯蚓體內的GSTs活性均顯著增加，處于激活狀態.敵百蟲質量濃度為0.06 g/L時，蚯蚓體內的GSTs活性達到最大，與對照組相比提高了79.5%.在敵百蟲質量濃度小于0.06 g/L時，隨著敵百蟲質量濃度的增加，蚯蚓GSTs的活性總體上呈增加趨勢；敵百蟲質量濃度超過0.06 g/L時，蚯蚓GST的活性又急劇下降.

2.2.2 敵百蟲對蚯蚓體內AChE活性的影響

不同質量濃度的敵百蟲對蚯蚓體內AChE活性的影響程度不同.由表1可見，敵百蟲質量濃度較低時，能夠激發蚯蚓體內AChE的合成能力，加快合成速度，使AChE含量上升[9].敵百蟲質量濃度達到0.04 g/L時，蚯蚓體內的AChE活性達到最大值.此后，隨著敵百蟲質量濃度的進一步升高至0.05 g/L，AChE活性下降，但仍高于對照組.敵百蟲質量濃度繼續升高至0.06 g/L后，蚯蚓體內的AChE活性低于對照組，即AChE的合成處于抑制狀態.

2.2.3 敵百蟲對蚯蚓體內Car E活性的影響

不同質量濃度的敵百蟲作用于蚯蚓后，總體上處理組CarE活性高于對照組，即呈現促進作用.由表1可見，敵百蟲質量濃度為0.04 g/L時，CarE活性達到最大；當敵百蟲質量濃度小于0.04 g/L時，CarE活性隨敵百蟲質量濃度的增加呈上升趨勢，說明敵百蟲在低質量濃度范圍內對CarE活性的促進作用隨著質量濃度的增加不斷加強；當敵百蟲質量濃度大于0.04 g/L時，CarE活性呈下降趨勢，即敵百蟲在高質量濃度范圍內隨著質量濃度的增加對CarE活性的促進作用減弱.總之，敵百蟲對蚯蚓體內的CarE有誘導作用，且低質量濃度的誘導作用強于高質量濃度.

3 討論與結論

本研究采用不同質量濃度的敵百蟲作用于蚯蚓，發現在研究的敵百蟲質量濃度范圍內，蚯蚓有中毒癥狀及死亡現象，且死亡率與敵百蟲質量濃度呈正比關系.測定蚯蚓在染毒48h后體內解毒酶的活性，結果發現：蚯蚓體內GSTs、AChE和CarE 3種解毒酶的活性均是先隨著敵百蟲質量濃度的升高而增加，這可能是機體對敵百蟲農藥的適應性反應，解毒酶活性的提高有助于減少異源物質對機體的損傷，該結果與吳咚咚等[11]的發現相似.在一定質量濃度下解毒酶活性達到峰值后，隨著敵百蟲質量濃度的進一步提高，解毒酶活性下降，甚至低于對照組.3種解毒酶均是在敵百蟲質量濃度為0.04 g/L活性很大，即該質量濃度下蚯蚓體內的解毒酶活性被充分激發，參與蚯蚓對有機磷類藥劑的代謝作用.當敵百蟲施用量超過蚯蚓機體承受范圍時，解毒酶的活性急劇下降，蚯蚓所受毒害作用不可修復.

本研究為探討蚯蚓抗藥性機制，建立抗性生化檢測提供理論依據，也為合理使用農藥減少其不良負作用積累基礎資料.

[1]張壬午，李治祥，白清云，等.化學農藥對生態環境安全評價研究Ⅱ.化學農藥對蚯蚓的毒性與評價[J].農村生態環境，1986，2（2）：14-18.

[2]徐冬梅，劉文麗，劉維屏.外源污染物對蚯蚓毒理作用研究進展[J].生態毒理學報，2009，4（1）：21-27.

[3]朱有芳，洪萬樹.敵百蟲對中國花鱸的毒性效應[J].生態學雜志，2011，30（7）：1484-1490.

[4]謝欽銘，李向陽.敵百蟲和久效磷農藥對蒙古裸腹蚤的急性毒性研究[J].水產科學，2007，3（26）：164-166.

[5]蒼濤，吳長興，王新全，等.氟蟲腈與敵百蟲對意大利蜜蜂的聯合毒性評價[J].浙江農業科學，2008，473（4）：473-475.

[6]白桂芬，祁茹，曾曉波，等.多菌靈和敵百蟲單一與復合污染對蚯蚓的毒性效應研究[J].四川動物，2010，29（3）：398-400.

[7]陳東亞，褚宏亮，楊維芳，等.德國小蠊谷胱甘肽S-轉移酶和乙酰膽堿酯酶活力與抗藥性的關系[J].中國媒介生物學及控制雜志，2009，20（6）：522-524.

[8]張玲，劉映紅，陳志永.取食CMV煙株的煙蚜谷胱甘肽S-轉移酶和羧酸酯酶活性變化[J].中國煙草學報，2007（3）：61-64.

[9]龐戰軍，陳瑗，周玫.谷胱甘肽硫轉移酶基因表達的調控[J].生物化學與生理物理進展，1997，24（5）：401-405.

[10]王軼，唐云，徐凌凌，等.阿苯噠唑對蚯蚓的生態毒理效應[J].應用生態學報，2009，20（9）：2296-2300.

[11]吳咚咚，趙建偉，陳穎，等.辣椒堿對煙粉虱體內羧酸酯酶、谷胱甘肽S-轉移酶和乙酰膽堿酯酶活性的影響[J].生物安全學報，2012，21（2）：109-113.

[12]何東海，孟范平，朱小山.有機磷農藥對海洋動物乙酰膽堿酯酶（AChE）的毒性效應研究進展[J].海洋通報，2003，22（6）：71-78.

[13]魏蓄強，錢坤，曾曉芃，等.羧酸酯酶與北京市不同城區德國小蠊對有機磷殺蟲劑抗性的關系[J].中國媒介生物學及控制雜志，2008，19（5）：413-417.