長角血蜱雌蜱不同發育時期唾液腺蛋白的組成分析

王 多，李海龍，劉敬澤

（河北師范大學生命科學學院，石家莊 050024）

長角血蜱（Haemaphysalis longicornis）隸屬硬蜱科（Ixodidae）血蜱屬（Haemaphysalis），在我國分布廣泛[1]，能夠傳播伯氏疏螺旋體（Borrelia burgdorferi）、貝氏考克次體（Coxiella burnetti）、埃里克體（Ehrlichia）、巴貝斯蟲（Babesia spp.）、泰勒蟲（Theileria spp.）等多種病原體[2-3]，對人類健康和畜牧業發展有極大危害[4].最新報道的新布尼亞病毒（Severe fever with thrombocytopenia syndrome virus，SFTSV）對長角血蜱的感染率為18.75%，且與病人的SFTSV聚在一支，表明SFTSV、病人和長角血蜱存在一定的關聯，長角血蜱極可能是SFTSV傳染的傳播媒介[5].

長角血蜱唾液腺（salivary gland，SG）位于體腔腹側面，由一對葡萄狀的腺泡組成.蜱唾液腺功能強大，在蜱類自由生活階段和吸血寄生過程中均發揮重要作用[6].蜱唾液腺還可儲存萊姆病、Q熱等多種疾病的病原體，并通過唾液將病原體傳遞至宿主[7-8].目前已從蜱唾液腺中發現許多抑制免疫反應和具有抗菌功能的蛋白，包括組胺結合蛋白、IgG結合蛋白、IL-2結合蛋白、p29蛋白和HL34等[9-11].因此，蜱唾液腺蛋白已成為生物學、免疫學和生物藥學研究的熱點領域之一[12].劉光遠等[13]和謝俊仁等[14]構建、篩選了長角血蜱唾液腺的cDNA文庫；Lee等[15]對唾液腺病原體進行了檢測；Shelby等[16]研究了激素對美洲花蜱（Ambylomma americanum）唾液腺發育的影響.唾液腺蛋白的含量和成分在蜱不同發育期的變化尚未報道.本研究以長角血蜱雌蜱為對象，分析其不同發育期唾液腺蛋白含量和成分的動態變化，以期為后續深入研究唾液腺蛋白及其功能奠定基礎.

1 材料與方法

1.1 長角血蜱的采集與飼養

長角血蜱采自河北省小五臺山國家級自然保護區的羊體，在實驗室條件下飼養繁殖.在家兔耳部進行寄生吸血，非寄生期在實驗室光照培養箱中培養，培養溫度為（27±1）℃，相對濕度75%，光照時間與黑暗時間的比例為6∶18.

1.2 長角血蜱雌蜱不同發育期唾液腺蛋白含量的測定

選取處于饑餓期（U）、吸血后 2 d（F2）、交配期（M）、飽血當天（E0）、飽血后 2 d（E2）和飽血后 4 d（E4）的雌蜱各50頭，冰浴條件下，在緩沖液（phosphate buffered saline，PBS，pH 7.2）中解剖出唾液腺，超聲破碎.4℃離心20 min（12 000 r/min），取上清液，－80℃保存備用，Bradford法進行蛋白質含量定量.

1.3 不同發育期雌蜱唾液腺蛋白成分的測定

采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法（SDS-PAGE）測定雌蜱唾液腺蛋白的成分[17].將提取的雌蜱唾液腺總蛋白溶液按照體積比為1∶0.2的比例加入質量分數為10%的SDS和微量溴酚蘭，混勻后在沸水中熱處理3 min，之后上樣.電泳條件為：質量分數為5%的濃縮膠，電壓設置為75 V，質量分數為12%的分離膠，電壓設置為120 V.電泳結束后取下凝膠，考馬斯亮蘭R250染色，酸甲醇脫色液脫色.Omega 12ic凝膠成像系統拍照，Gel-Pro Analyzer 4.0軟件進行分析.

2 結果

2.1 不同發育期雌蜱唾液腺總蛋白的含量

雌蜱唾液腺總蛋白含量隨發育期的不同而變化，且各期的蛋白含量差異顯著，具有統計學意義（p＜0.05），如圖1所示.

圖1 長角血蜱雌蜱不同發育期唾液腺總蛋白的含量Fig.1 Total protein content of salivary gland in femaleh.longicornis at different developmental stages

由圖1可以看出，饑餓期雌蜱的唾液腺蛋白含量最低（9.51μg/頭）.隨著吸血時間的延長，蛋白含量逐漸升高，至交配期唾液腺蛋白含量出現峰值（84.40μg/頭）.隨后，唾液腺蛋白的含量逐漸下降，飽血后4 d時蛋白含量僅為峰值的1/4.

2.2 不同發育期雌蜱唾液腺蛋白成分的變化

長角血蜱雌蜱的唾液腺蛋白經PBS提取后，利用SDS-PAGE進行分析，結果如圖2所示.

圖2 不同發育期長角血蜱雌蜱唾液腺蛋白成分Fig.2 Protein profile of salivary gland in femaleh.longicornis at different developmental stages

由圖2可以看出，隨著吸血時間的延長，雌蜱唾液腺蛋白的條帶變化明顯.饑餓期雌蜱唾液腺蛋白帶出現17條，吸血后2 d（F2）蛋白條帶增加至23條.交配時雌蜱唾液腺蛋白的條帶數最多，達到26條，交配后至飽血后4 d，蛋白條帶無明顯變化，保持在26條.從饑餓期至飽血后4 d，各發育期均有5條明顯主帶，其蛋白相對分子質量由大到小為97、84、74、45和32 kDa.

3 討論與結論

蜱類在叮咬吸血過程中，唾液腺質量增加，結構重組明顯，分泌多種功能物質抑制宿主免疫反應，進而使其成功獲得宿主血液，并有助于傳遞病原體至宿主，如蜱類分泌的唾液能夠刺激宿主IL-10和IL-4等細胞因子的合成，進而可以選擇性地減少巨噬細胞或淋巴細胞的產生，降低宿主對蜱類或病原體的免疫反應[18].長角血蜱唾液腺鑒定出的黏合劑成分則有助于吸血過程中口器固定[19].此外，不斷有抗凝血酶、抗菌肽等蛋白類功能物質在蜱類唾液腺中被鑒定出，由此可見蜱類唾液腺蛋白在蜱類生命活動過程中發揮著重要作用.本研究對長角血蜱不同發育期的唾液腺蛋白含量及成分進行分析，結果表明，饑餓期長角血蜱雌蜱的唾液腺蛋白含量最低，交配期蛋白含量最高，飽血后蛋白含量開始下降.該過程可能與蜱類的飽血過程密切相關，吸血初期蜱類的吸血緩慢，唾液腺逐漸發育，體積變大，蛋白含量上升.交配可以使長角血蜱進入快速吸血期，此時蜱類唾液腺功能最為強大，蛋白含量達到峰值.飽血后，蜱類唾液腺逐漸退化，體積變小，蛋白含量逐漸降低.

SDS-PAGE分析表明，隨著吸血的進行，長角血蜱雌蜱的唾液腺蛋白成分不斷增加，饑餓期唾液腺蛋白為17條，吸血初期增加至23條，交配期達到峰值，交配期至飽血后蛋白條帶無明顯變化.這表明吸血的起始能夠促進唾液腺發育，觸發唾液腺分泌功能蛋白，如黏合劑蛋白、抗凝血酶蛋白等，這些蛋白有助于蜱類叮咬吸血的持續進行.交配后長角血蜱進入快速吸血期，多種唾液腺蛋白共同作用促進長角血蜱大量吸血.交配期至飽血后蛋白條帶雖無明顯變化，但蛋白含量明顯降低，表明蜱類唾液腺在飽血后發育過程中的功能逐漸下降，唾液腺逐步退化.在整個吸血至飽血過程中，5條蛋白主帶有明顯變化.97 kDa蛋白主帶饑餓期存在，吸血2 d后含量增多，交配期和飽血當天含量最為豐富，飽血后含量逐漸降低，該蛋白與唾液腺蛋白含量變化趨勢一致.45 kDa蛋白不僅在長角血蜱雌蜱的唾液腺中可檢測到，在美洲花蜱（Amblyomma americanum）、變異革蜱（Dermacentor variabilis）和達明硬蜱（Ixodesdammini）中都有存在[20]，這表明唾液和唾液腺中的一些蛋白成分在硬蜱中具有一定的保守性.

目前蜱類唾液腺的研究多集中于病原體及生理功能方面，而唾液腺發育調控因子及作用機理、功能蛋白的分離、純化和結構鑒定以及蛋白質組學等方面的研究亟待開展.此類研究對于蜱類防治、人類健康及農牧業的發展將具有重要意義.

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