長角血蜱Pmy蛋白在大腸桿菌中表達(dá)條件的優(yōu)化

崔雪嬌，張?zhí)鹛穑軋@園，梁婷婷，胡永紅

（河北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，石家莊050024）

長角血蜱（Haemaphysalis longicornis）在我國分布廣泛，種群數(shù)量大，能夠傳播瑟氏泰勒蟲（Theileria sergenti）、犬吉氏巴貝斯蟲（Babesia gibsoni）等病原體，是人類健康和畜牧業(yè)生產(chǎn)的潛在威脅[1]，抗蜱疫苗是最有效的防治蜱類和蜱媒病的策略之一[2-3]，研制抗蜱疫苗關(guān)鍵是要篩選出一種能有效刺激宿主產(chǎn)生抗蜱能力的抗原，即保護(hù)性抗原.

副肌球蛋白（paramyosin，Pmy）是大多數(shù)無脊椎動(dòng)物肌細(xì)胞中粗肌絲的主要成分，單體相對分子質(zhì)量約為97 kDa（1kDa=1 000摩爾質(zhì)量），其結(jié)構(gòu)為桿狀，中間為α-螺旋結(jié)構(gòu)[4].研究表明，Pmy有顯著的免疫原性，可作為疫苗候選抗原，已在血吸蟲、線蟲和絳蟲等寄生蟲防治研究中報(bào)道[5-7].而蜱類僅有微小扇頭蜱（Rhipicephalusmicroplus）和肩突硬蜱（Ixodesscapularis）中報(bào)道過該蛋白的序列及理化特征[8]，有關(guān)Pmy表達(dá)條件優(yōu)化的研究尚未見報(bào)道.本研究在前期成功構(gòu)建長角血蜱Pmy表達(dá)載體的基礎(chǔ)上，將重組質(zhì)粒pET-32（a+）-pmy轉(zhuǎn)入大腸桿菌E.coli BL21中，通過改變誘導(dǎo)時(shí)間、誘導(dǎo)溫度及IPTG濃度，探究Pmy蛋白原核表達(dá)的最優(yōu)條件，為進(jìn)一步研制抗蜱疫苗奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

含有 pET-32（a+）-pmy的 E.coli BL21 菌種，由河北師范大學(xué)動(dòng)物生理生化與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存.

LB培養(yǎng)基：10 mg/mL蛋白胨、5 mg/mL酵母提取物、10 mg/mLNaCl，pH 為 7.2.

蛋白胨、酵母提取物和氨芐青霉素（Amp）均為國產(chǎn)分析純（北京索萊寶科技有限公司）；異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）（上海翊圣生物科技有限公司）；蛋白marker（Fermentas公司）.

高速冷凍離心機(jī)（Thermo公司）；電泳槽（BIORAD公司）；恒溫培養(yǎng)箱（培英公司）；凝膠成像儀（Alpha Innotech公司）；－80℃超低溫冰箱（Thermo公司）；脫色搖床（南京新校園生物研究所）.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌種活化、擴(kuò)培和表達(dá)

菌種活化：將本實(shí)驗(yàn)室保存的含有質(zhì)粒pET-32（a+）-pmy的菌液按體積比為1∶100的比例接種于5 mL的LB（含100μg/mL的 Amp）液體培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)過夜.

菌種擴(kuò)培：取過夜培養(yǎng)的菌液，按體積比為1∶100的比例接種于LB（含100μg/mL的Amp）液體培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min振蕩培養(yǎng).

誘導(dǎo)表達(dá)：當(dāng)菌液OD600為0.4～0.6時(shí)，加入IPTG至終濃度為 0.5 mmol/L，在不同溫度（18、25、30 和37 ℃）、不同時(shí)間（2、4、6、8和 12h）下誘導(dǎo)重組蛋白的表達(dá)，并分別收集菌液，10 000 r/min下離心10 min，收集菌體進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測，以確定重組蛋白的最佳表達(dá)條件.

在獲得最佳誘導(dǎo)溫度和時(shí)間后，向菌液中分別加入不同濃度的 IPTG（0.2、0.4、0.6、0.8 和 1.0 mmol/L），通過SDS-PAGE電泳檢測重組蛋白的表達(dá)量，以確定最適的IPTG誘導(dǎo)濃度.

1.2.2 SDS-PAGE凝膠電泳

采用SDS-PAGE電泳，濃縮膠（pH為6.8）和分離膠（pH為8.8）的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為5%和12%.電極緩沖液均為Tris-甘氨酸緩沖液（pH為8.3），含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的SDS.上樣量為每孔20μL，以溴酚藍(lán)為指示劑.當(dāng)指示劑在濃縮膠中時(shí)，選用等壓80 V電泳，待樣品進(jìn)入分離膠后調(diào)節(jié)電壓到120 V.電泳在4℃冰箱中進(jìn)行，當(dāng)溴酚藍(lán)移動(dòng)到膠底部時(shí)停止電泳，迅速進(jìn)行固定染色.

1.2.3 凝膠的染色和脫色

將凝膠放入考馬斯亮藍(lán)R-250染色液中染色30 min，用蒸餾水漂洗后，置脫色液（體積分?jǐn)?shù)分別為10%的甲醇、10%的冰醋酸和80%的蒸餾水）中脫色，更換脫色液直至凝膠背景呈現(xiàn)清亮為止.凝膠染色和脫色均放置于脫色搖床上，以使染色和脫色均勻.

2 結(jié)果與分析

2.1 誘導(dǎo)溫度對Pm y重組蛋白表達(dá)的影響

設(shè)定誘導(dǎo)時(shí)間為6h，誘導(dǎo)溫度分別為18、25、30和37℃，同時(shí)在37℃條件下，以不含重組質(zhì)粒的菌種作對照，不同溫度下IPTG誘導(dǎo)Pmy重組蛋白（rPmy）表達(dá)的SDS-PAGE電泳結(jié)果如圖1所示.

圖1 不同溫度下誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)的SDS-PAGE電泳圖Fig.1 SDS-PAGE electrophoresis of recombination protein expression at different tem peratures

由圖1可以看出，第5道對照組菌種不含Pmy重組質(zhì)粒，因此120 kDa處未表達(dá)重組蛋白rPmy.而第1道至第4道菌種含Pmy重組質(zhì)粒，在120 kDa處檢測到rPmy表達(dá).隨著溫度的升高，rPmy表達(dá)量隨之升高.在37℃條件下，rPmy的表達(dá)量達(dá)到最大.這說明37℃時(shí)菌種繁殖最快，蛋白表達(dá)量最多.

2.2 誘導(dǎo)時(shí)間對Pm y重組蛋白表達(dá)的影響

選用0.5 mmol/L的IPTG、37℃條件下誘導(dǎo)rPmy的表達(dá)，誘導(dǎo)時(shí)間分別設(shè)置為 2、4、6、8和 12h；同時(shí)以第1道中不含重組質(zhì)粒的菌種誘導(dǎo)6h作對照.SDS-PAGE電泳結(jié)果如圖2所示.

圖2 不同誘導(dǎo)時(shí)間下重組蛋白表達(dá)的SDS-PAGE電泳圖Fig.2 SDS-PAGE electrophoresis of recombination protein expression in different induction time

由圖2可以看出，對照組菌種不含Pmy重組質(zhì)粒，因此未檢測到rPmy.2～6道含Pmy重組質(zhì)粒的菌種中均檢測到rPmy的表達(dá).隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加，rPmy表達(dá)量隨之升高，在誘導(dǎo)8h時(shí)，rPmy表達(dá)量達(dá)到最大，而誘導(dǎo)12h后，rPmy表達(dá)量降低.因此，在其他條件相同的情況下，誘導(dǎo)8h為重組表達(dá)的最佳誘導(dǎo)時(shí)間.

2.3 IPTG濃度對Pm y重組蛋白表達(dá)的影響

設(shè)定誘導(dǎo)溫度為37℃、誘導(dǎo)時(shí)間為6h，IPTG的濃度分別設(shè)置為 1.0、0.8、0.6、0.4 和 0.2 mmol/L，觀察IPTG濃度對Pmy重組蛋白表達(dá)的影響，SDS-PAGE電泳結(jié)果如圖3所示.

圖3 不同IPTG濃度條件下重組蛋白表達(dá)的SDS-PAGE電泳圖Fig.3 SDS-PAGE electrophoresis of recombination protein expression with different IPTG concentration

由圖3可以看出，IPTG濃度分別為1.0、0.8、0.6和0.4 mmol/L時(shí)，rPmy表達(dá)量無明顯差異，均較高；IPTG濃度為0.2 mmol/L時(shí)，rPmy的表達(dá)量最低.考慮到IPTG的用量，在其他條件相同的條件下，IPTG最適濃度為0.4 mmol/L.

3 結(jié)論

對于本研究的原核載體而言，37℃，誘導(dǎo)8h，IPTG濃度大于0.2 mmol/L時(shí)，長角血蜱Pmy蛋白表達(dá)量較高.

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