惡性胸腹腔積液中腫瘤細胞的TSmRNA表達水平與培美曲塞藥物敏感性關系

樊衛飛 王峻 王琳 孟麗娟 蒲驍麟 楊民 許菊青

惡性胸腹腔積液中腫瘤細胞的TSmRNA表達水平與培美曲塞藥物敏感性關系

樊衛飛 王峻 王琳 孟麗娟 蒲驍麟 楊民 許菊青

目的 分析惡性胸腹腔積液中原代腫瘤細胞胸苷酸合成酶（TS）基因的mRNA表達水平，探討TS基因在惡性胸腹腔積液患者中對培美曲塞藥物化療療效的預測作用。 方法 收集39例經病理確診的Ⅳ期惡性腫瘤患者的惡性胸腹腔積液，分離原代腫瘤細胞，采用ATP-TCA法體外藥物敏感試驗檢測化療藥物對原代腫瘤細胞的抗腫瘤作用；提取原代腫瘤細胞的總RNA，采用實時熒光定量PCR方法檢測原代腫瘤細胞中培美曲塞藥物療效相關基因TS的相對表達水平。 結果 在惡性胸腹腔積液中，原代腫瘤細胞中TSmRNA的相對表達水平與惡性腫瘤患者的臨床特征無明顯相關性（P＞0.05）；TSmRNA表達水平與培美曲塞藥敏結果呈負相關，TS低表達，培美曲塞更敏感（P＜0.05）。 結論 惡性胸腹腔積液中原代腫瘤細胞TSmRNA的表達水平與培美曲塞體外藥物敏感性相關。對于有惡性胸腹腔積液患者，可通過簡單的胸腹腔穿刺獲得與化療藥物療效相關的基因信息，從而為惡性胸腹腔積液患者實施個體化治療提供理論基礎。

胸苷酸合成酶；惡性胸腹腔積液；培美曲塞

惡性腫瘤的治療問題是當今醫學領域廣泛關注的研究方向。由于腫瘤本身和不同病人之間腫瘤異質性的存在，使得目前應用的抗腫瘤藥物對≥70%的患者療效有限。檢測腫瘤的藥物敏感性基因，參考檢測結果選擇敏感的藥物進行個體化治療，已經成為當前提高療效、減少無效治療的有效措施［1-2］。絕大多數晚期惡性腫瘤患者在疾病進展過程中均會發生轉移，與原發灶相比，轉移灶具有不同的生物學行為。培美曲塞是新一代多靶點葉酸拮抗劑，在非小細胞肺癌（NSCLC）的治療中取得了較好的療效［3］，同時在胃腸消化道腫瘤治療中作為二線化療藥物的地位逐漸提高。胸苷酸合成酶（TS）是DNA合成的關鍵酶，其表達水平可能與培美曲塞的療效相關［4-5］。

臨床上，惡性胸腹腔積液是一種易于獲取的標本，相對于病情較晚無手術適應證患者或者體力狀況較差、年齡較高無法耐受胃腸鏡、支氣管鏡、穿刺活檢等操作的患者顯得尤為重要。且對患者創傷較少，可重復操作，因此惡性胸腹腔積液在個體化療領域具有獨特的意義［6-8］。

本研究旨在探索：（1）腫瘤特殊轉移灶即惡性胸腹腔積液中腫瘤細胞的TSmRNA表達水平與培美曲塞藥物敏感性的關系；（2）惡性胸腹腔積液是否可以作為一種合適的標本，以獲得藥物敏感性預測分子方面的信息，從而為實施個體化治療提供理論依據。

1 對象與方法

1.1 對象

1.1.1 藥品與試劑：TRIzol試劑盒為GIBCO公司產品；實時熒光定量 PCR試劑盒 ExTaq R-PCR為TaKaRa產品；培美曲塞由江蘇豪森醫藥股份公司提供（國藥準字 H20051288）；細胞活性螢光檢測試劑CellTiter-GIo Luminescent Cel Viability Assay為美國Promega公司產品；Taqman探針及引物為美國ABI公司產品；其余試劑為國產分析純。

1.1.2 研究對象：收集2010年3月至2014年8月在我院經病理確診的轉移性惡性胸腹腔積液患者共39例，男20例，女19例，年齡34～81歲，平均（61.0± 5.2）歲，其中包含NSCLC組17例，胃腸癌組22例，其中胃癌10例，腸癌12例。經細胞涂片病理學檢查證實，惡性胸腹腔積液中腫瘤細胞含量≥50%；患者標本收集前1月未接受過全身抗腫瘤治療或胸腹腔局部治療；需要記錄的基本項目（包括患者的病理資料，在病程中先后使用的化療藥物，以及使用療效，生存期）在病歷中完整記載。

1.2 方法

1.2.1 分離腫瘤細胞：將收集的惡性胸腔或腹腔積液離心；小心吸取中間白膜層至新管中加入紅細胞裂解液20 ml，用含抗生素的RPMI 1640洗滌細胞。

1.2.2 ATP-TCA法藥物敏感性測定：調整細胞濃度，接種于96孔板，同時加入不同濃度的化療藥物，同時設立無藥對照組（MO）和ATP最大抑制對照組（MI），每組設12個平行孔。將培養板于37℃、5%二氧化碳飽和濕度的培養箱孵育6 d后取出；加入CellTiter-GIo試劑，應用Berthold Detection Systems微孔板光度計檢測熒光值，并計算各藥物濃度下腫瘤細胞的生長抑制率；抑制率（inhibition rate，IR）=［1-（實驗組熒光值-MI熒光值）/（MO熒光值-MI熒光值）］×100%。藥物敏感指數為600表示最大范圍的細胞存活，即最小程度的藥物敏感；藥物敏感指數為0表示細胞完全死亡，即最大程度的藥物敏感。藥物敏感指數越小，說明細胞對該藥越敏感。

1.2.3 RNA提取及cDNA的合成：分離后的胸腹腔積液腫瘤細胞，參照Trizol的說明書提取細胞總RNA。配制逆轉錄反應體系，逆轉錄完成后，將cDNA置于-20℃保存。

1.2.4 實時熒光定量PCR：將各組cDNA溶液分別與SYBRpPCR混合物、上下游引物、滅菌蒸餾水一起加樣。實時熒光定量 PCR循環參數為：95℃預變性10 s，95℃變性5 s，60℃退火，延伸30 s，45個循環。TS引 物 序 列：5′-TCAGCGAGAACCCAGACC-3′。5′-CCAGTGGCAACATCCTTAA-3′；β-actin引物序列：5′-TATGACTTAGTTGCGTTACACC-3′。5′-CCTTCACCGTTCCAGTTT-3′，瓊脂糖凝膠電泳30 min。凝膠圖像分析儀分析結果。

1.3 統計學分析 組間定量資料比較分析采用t檢驗，在分析相關基因表達水平與藥物敏感性的關系時，如果數據符合正態分布或經對數轉換后符合正態分布則采用Pearson's相關分析，反之則采用Spearman相關性分析。統計軟件為SPSS 18.0。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 惡性胸腹腔積液中培美曲塞藥物敏感指數與腫瘤細胞TSmRNA表達的相對定量 本研究中標本收集、處理過程中嚴格無菌操作，ATP-TCA檢測得以在全部標本中完成。TSmRNA在原代腫瘤細胞中的表達以及培美曲塞在不同組別的藥物敏感指數見表1。原代腫瘤細胞對培美曲塞的敏感性與患者臨床病理特征：TSmRNA在NSCLC細胞中的表達水平低于在胃腸癌細胞中的表達水平。TSmRNA的表達與患者的年齡、性別、原發腫瘤類型均無關。

表1 2組胸腹腔積液中培美曲塞藥物敏感指數與腫瘤細胞TSmRNA表達的相對定量

2.2 TSmRNA的表達和腫瘤對培美曲塞的敏感指數的相關性 TSmRNA的表達和腫瘤對培美曲塞的敏感指數呈顯著正相關（NSCLC組r=0.672，P=0.03；胃腸癌組r=0.506，P=0.048），即惡性胸腹腔積液中低表達TSmRNA者體外對于培美曲塞敏感性高。見圖1及圖2。

3 討論

圖1 NSCLC組TSmRNA表達及對培美曲塞敏感性的關系

圖2 胃腸癌組TSmRNA表達及對培美曲塞敏感性的關系

現有的多項體外實驗表明，肺癌細胞中TS高表達將降低其對培美曲塞的敏感性［9］。有研究發現采用培美曲塞為基礎的方案治療NSCLC，TS低表達患者的無疾病進展期（PFS）明顯高于高表達者；同時還發現低表達患者的總生存期（OS）也明顯高于高表達患者［10］。在本項研究中，我們首次試圖探索在特殊的腫瘤轉移灶即惡性胸腹水中腫瘤細胞TSmRNA表達水平與培美曲塞藥物敏感性的關系。既往研究多關注原發腫瘤，且檢測標本大多數采集于化療前，而病人經多周期化療后可產生一定程度耐藥性，而惡性胸腹腔積液在采集后立即行分子生物學檢測，具有實時性，可為實時個體化治療提供理論依據。

本試驗結果表明，不論在肺癌組還是在胃腸癌組，惡性胸腹腔積液中腫瘤細胞TSmRNA表達水平均與培美曲塞藥物敏感性呈負相關；即TSmRNA低表達者體外培美曲塞敏感性高。

總而言之，對于伴有惡性胸腹腔積液的進展期NSCLC以及胃腸癌患者，有可能通過相對簡單、無創的胸腹腔穿刺獲得合適的標本進行相關基因表達的分析，從而實現對化療藥物敏感性的預測，為實施腫瘤的個體化治療帶來希望。當然，由于體外藥物敏感試驗的結果不能完全等同于體內病人對該種藥物的反應性，臨床前試驗的結果仍然有待于在進一步大樣本臨床試驗中得到證實。但由于本研究的樣本量較少，其價值和可靠性尚需要更多研究結果的支持。

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Relationship between mRNA expression of thym idylate synthase（TS）in malignant p leural and peritoneal effusions and chemosensitivity to pemetrexed

FAN Wei-fei，WANG Jun，WANG Lin，MENG Li-juan，PU Xiao-lin，YANGMin，XU Ju-qing. Department ofOncology，Jiangsu Provincial Geriatric Hospital，Nanjing 210024，China

Objective To explore themRNA expression of thymidylate synthase（TS）in tumor cells isolated from malignant pleural and peritoneal effusions，and to investigate the predictive role of TS to the efficacy of pemetrexed-based chemotherapy. M ethods Tumor cells were isolated from malignant pleural and peritoneal effusions of 39 patients with malignant tumor.Viable tumor cells were tested for sensitivity to pemetrexed using ATP-TCA assay.RT-PCR was used to examine the TS mRNA level in the primary cultured cancer cells. Results The expression level of TS mRNA in malignant effusions was negatively correlated with pemetrexed sensitivity.The expression of TSmRNA was not related to age，gender or tumor type. Conclusions The results indicate that the expression level of TS mRNA in malignant effusions is negatively correlated with sensitivity to pemetrexed.Chest or abdominal puncturemay play an important role for “real-time”individualized chemotherapy while tumor progression.

thymidylate synthase；malignant pleural and peritoneal effusions；pemetrexed

R 734

A

10.3969/j.issn.1003-9198.2015.09.011

江蘇省衛生廳醫學科研面上項目（H201329）；江蘇省六大高峰項目（2013-WSN-057）

210024江蘇省南京市，江蘇省老年醫院腫瘤科

2015-03-10）