口蹄疫O型液相阻斷ELISA免疫抗體檢測方法的應用

胡珊蓮

（上海市閘北區光明荷斯坦軟業有限公司，上海閘北200436）

口蹄疫O型液相阻斷ELISA免疫抗體檢測方法的應用

胡珊蓮

（上海市閘北區光明荷斯坦軟業有限公司，上海閘北200436）

應用液相阻斷ELISA試驗方法檢測上海光明荷斯坦牧業有限公司牧場牛群經口蹄疫O型滅活疫苗免疫的奶牛血清樣品2412份。經檢測，2412份樣品中規模奶牛場牛群免疫抗體滴度≤1∶64樣品42份，抗體滴度≥1∶128樣品2370份，抗體保護率為98%。

液相阻斷ELISA；O型口蹄疫；抗體檢測；奶牛

口蹄疫屬我國農業部公布的一類動物疫病，是由口蹄疫病毒引起偶蹄動物的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病，以牛，豬最易感，羊、駱駝、象等均有發病報告。該病可分為O、A、C、南非Ⅰ型、南非Ⅱ型、南Ⅲ型和亞洲Ⅰ型等7個血清型，其中以O型和A型分布最廣，危害最大。

本試驗應用液相阻斷ELISA檢測方法跟蹤檢測上海光明荷斯坦牧業有限公司下屬牧場O型口蹄疫疫苗免疫抗體滴度水平，以利及時指導下屬牧場O型口蹄疫防疫工作，為牧場健康發展提供有效保障。現將檢測應用情況報告如下。

1 材料與方法

1.1 檢測樣品 上海光明荷斯坦牧業有限公司下屬牧場牛群經口蹄疫O型滅活疫苗（JYBL-2014-5-21）免疫的奶牛血清樣品2412份。

1.2 實驗器材 酶標儀、37℃恒溫溫箱；5.0～50.0協L移液器、50.0～200.0協L移液器及50.0～300.0協L 12道移液器；配套移液槍尖，移液槽；吸水紙；96孔平底酶標板；96孔U形底聚丙烯微量抗原抗體反應板；檢測試劑盒系采用中國農科院蘭州獸醫研究所口蹄疫O型抗體液相阻斷ELISA檢測試劑盒。

1.3 實驗步驟

1.3.1 牛群免疫 應用口蹄疫O型滅活疫苗按照產品說明書規定免疫劑量及免疫方法對公司下屬牧場牛群接種免疫，于2免21 d后采血進行免疫效果檢測。

1.3.2 試劑準備 包被緩沖液（pH9.6）、磷酸鹽-吐溫緩沖液（PBST）、PBST稀釋液、底物溶液按試劑盒說明書進行配制。

1.3.3 包被 pH9.6包被緩沖液稀釋口蹄疫O型病毒兔抗血清至工作濃度（1∶1000），混合均勻，酶標板上每孔加入50協L，振蕩，封板室溫過夜，使抗體在pH9.6條件下吸附于酶標板上。

1.3.4 抗原抗體反應（對照血清及待檢血清） 以 96孔U型微量血凝板檢測，以20份樣品為例，需板2塊，血清以倍比稀釋法進行（注：空白孔為無樣品加入）。

A.加PBST稀釋。A1—A10加入150協L PBST稀釋液，B1—B10，C1—C10，D1—D10，E1—E10各加入50協L PBST稀釋液。H1加入150協L PBST稀釋液，H2—H10各加入50協L PBST稀釋液，A12—B12各加50協L PBST稀釋液。

B.加血清稀釋。在A1中加入50協L待檢血清樣品，混勻后取50協L加入B1，再混勻后取50協L加入C1連續2倍稀釋（從A1 1∶4倍開始稀釋到E1 1∶64倍，A1—A10共10個樣品），直至加到E1混勻，再從E1中吸取50協L棄去。陽性血清取50協L加入H1，混勻后取50協L加入到H2，直至加入到H10混勻，再從H10中吸取50協L棄去（從H1 1∶4倍開始稀釋到H10 1∶2048倍）。陰性血清取50協L加入A12，混勻后取50協L加入B12，混勻后取50協L棄去。

C.加病毒抗原。口蹄疫O型病毒抗原用PBST稀釋液稀釋到工作濃度（1∶12，即1份病毒抗原加11份PBST），96孔U型微量血凝板中待檢樣品血清及陰陽性血清每孔加50協L，加入等量工作濃度的病毒抗原后，血清稀釋度加倍。E12—H12四個對照孔各加100協L稀釋至工作濃度的病毒抗原。振蕩，蓋膜封板，2～8℃過夜（詳見圖1）。

圖1 96孔U型微量血凝板10份血清加入工作濃度病毒抗原后的濃度表

1.3.5 洗酶標板及抗原抗體轉移 先將2塊抗原抗體反應板從4℃中取出室溫放置，用PBST稀釋液連續洗酶標板4次，吸水紙上甩干，再將抗原抗體混合物從反應板上按次序轉移至酶標板上的對應孔，每孔加50協L，封板，37℃溫育60 min（詳見圖2）。

1.3.6 洗酶標板及加豚鼠抗血清 用PBST稀釋液連續洗酶標板4次，吸水紙上甩干，用豚鼠抗血清稀釋液將口蹄疫O型病毒豚鼠抗血清稀釋至工作濃度（1∶1000），每孔加50協L，封板，37℃溫育60 min。

圖2 96孔酶標板檢測20份樣品布局圖

1.3.7 洗酶標板及加辣根過氧化物酶 用PBST稀釋液連續洗酶標板4次，吸水紙上甩干，用PBST稀釋液將兔抗豚鼠IgG—辣根過氧化物酶結合物稀釋至工作濃度（1∶500），每孔加50協L，封板，37℃溫育60 min。

1.3.8 洗酶標板及加底物溶液 用PBST稀釋液連續洗酶標板4次，吸水紙上甩干，加50協L底物溶液（底物溶液每1 mL加10協L 3%雙氧水），封板，37℃溫育15min。

1.3.9 加終止液 15 min后，每孔加50協L終止液終止反應，在酶標儀上讀取D492 nm值。

1.4 實驗結果判定

1.4.1 實驗認可標準 每板設4孔病毒抗原對照，病毒抗原對照不加任何血清，直接用PBST稀釋至使用濃度，與血清/病毒抗原復合物同步加入ELISA板孔，50.0協L/孔，病毒抗原對照D492 nm值應在1.5士0.5范圍內。陽性對照抗體效價應在（1∶1024）士1滴度內，陰性對照血清抗體效價應＜1∶8。

病毒抗原對照平均D492 nm值50.00%計算（臨界值），抗原對照4孔，棄去最高和最低D492 nm OD值，計算剩余2孔的平均D492 nm值，除2，即50.00%對照值。該值即為臨界值，表示阻斷50.00%反應的對照D492 nm值。

1.4.2 結果判定標準 以病毒抗原對照平均D492 nm值的50.00%為臨界值，被檢血清稀釋孔D492 nm值＞臨界值的孔為陰性孔，≤臨界值的孔為陽性孔，陽性孔的D492 nm值=臨界值時所對應的稀釋度為該份血清的抗體滴度。

2 結果與分析

2.1 病毒抗原對照D492 nm值 2412份檢測血清樣品，共采用121個ELISA板，484個病毒抗原對照D492 nm值在1.1～2.0范圍內。

2.2 陰、陽性對照血清抗體效價 121個牛群檢測血清樣品ELISA板臨界值均在對應板陽性對照血清1∶1024士1滴度的D492 nm值內，121個陰性對照血清樣品1∶8處滴度的D492 nm值均≥相應板的臨界值相。

2.3 O型口蹄疫牛群免疫抗體效果 對上海光明荷斯坦牧業有限公司所屬牛群2免21 d后進行口蹄疫O型滅活疫苗免疫抗體檢測，采血檢測2412份血樣，ELISA抗體效價≥1∶128，2370份，判為O型口蹄疫抗體陽性，98%以上保護，ELISA抗體效價1∶64～1∶128則抗體滴度，取中間值為1∶90，判為可疑，50%以上保護。ELISA抗體效價≤1∶64，42份，判為O型口蹄疫抗體陰性，不保護。

3 小結與討論

3.1 液相阻斷ELISA用于檢測家畜血清中的口蹄疫（FMD）抗體，具有靈敏性、特異性、穩定性，能及時、準確的跟蹤監測牛群O型口蹄疫免疫抗體，能有效指導牛群O型口蹄疫防控工作，是牛群0型口蹄疫免疫抗體跟蹤監測的首選試驗檢測方法。

3.2 本次試驗為公司下屬牧場所使用代號JYBL-2014-5-21的口蹄疫O型滅活疫苗抗體效價檢測提供了有效試驗數據，能有效指導下屬牧場O型口蹄疫防疫工作，為防控口蹄疫O型疫病提供了有效保障。

結果表明，抗體效價保護率為98%。

S858.23

A

1005-7307（2015）01-0003-003

2014-11-21