黃原膠寡糖琥珀酸酯衍生物的制備及其對野油菜黃單胞菌的抑菌性能研究

孫　濤，徐宏蕾，周可鵬，謝　晶，薛　斌，邵則淮，吳逸飛

（上海海洋大學食品學院，上海水產品加工及貯藏工程技術研究中心，上海201306）

黃原膠寡糖琥珀酸酯衍生物的制備及其對野油菜黃單胞菌的抑菌性能研究

孫濤，徐宏蕾，周可鵬，謝晶，薛斌，邵則淮，吳逸飛

（上海海洋大學食品學院，上海水產品加工及貯藏工程技術研究中心，上海201306）

將堿性條件下制備的黃原膠寡糖與琥珀酸酐進行反應，得到三種不同取代度的黃原膠寡糖琥珀酸酯衍生物（SA-XG-1、SA-XG-2、SA-XG-3），凝膠滲透色譜（GPC）法測定產物分子量分別為7560、6400和7430u。三種衍生物的取代度分別為0.18、0.32和0.43。采用瓊脂平板打孔法、最低抑菌濃度以及生長曲線法，考察了三種衍生物對野油菜黃單胞菌的抑菌能力；檢測了三種衍生物對野油菜黃單胞菌細胞膜通透性影響。結果表明，隨取代度的上升，抑菌圈縮小，最小抑菌濃度升高，對野油菜黃單胞菌細胞膜破壞能力減弱。當分子量相仿、丙酮酸和還原糖含量相近時，衍生物的抑菌性能可能與其取代度有關；但取代度上升，衍生物對野油菜黃單胞菌細胞膜破壞減弱，表明破壞細胞膜通透性是抑菌主要機理之一。

黃原膠，取代度，抑菌性

黃原膠，又稱單胞多糖，是一種由野油菜黃單胞菌（X.campestris）分泌的胞外多糖，由D-葡萄糖、D-甘露糖、D-葡萄糖醛酸、乙酸、丙酮酸組成的“五糖重復單元”構成［1］。由于黃原膠分子之間靠氫鍵作用而形成規則螺旋和保護，使得黃原膠的官能團被包圍在內部，只有水溶性較好的低分子量黃原膠才會表現出一些生物活性。黃單胞菌屬是植物病原菌，對一百多種單子葉植物和數百種雙子葉植物有危害。其中野油菜黃單胞菌是引起十字花科植物黑腐病的重要病原菌，會嚴重影響甘藍、白菜、花椰菜、薺菜和蘿卜等植物的產量和質量，對蔬菜產業影響重大［2-3］。研究表明［4］將卡拉膠低聚糖進行酰基化可以增強其抗菌性，其抗凝血、抗氧化及抑菌性都有很大的提升；將黃原膠進行琥珀酰基化反應制備黃原膠寡糖琥珀酸酯衍生物，其抗氧化活性明顯增強的研究也已見報道［5］，但是其抑菌性能及機理的研究罕見報道。

本文在堿性條件下降解黃原膠得到黃原膠寡糖，而合成三種黃原膠寡糖琥珀酸酯衍生物，并考察了三種衍生物對野油菜黃單胞菌的抑制作用，以及對野油菜黃單胞菌細胞膜通透性的影響，為黃原膠寡糖衍生物抑菌機理的研究提供參考。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

黃原膠食品級，上海聯合食品添加劑有限公司；琥珀酸酐分析純，上海化學試劑公司；野油菜黃單胞菌上海海洋大學食品學院提供；其他試劑為分析純。

YXQ-SG46-280S型手提式壓力蒸汽滅菌鍋上海博迅實業有限公司；SW-CJ-1F型凈化工作臺蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司；THZ-82N型臺式恒溫振蕩器上海躍進醫療器械廠；PYX-DHS-40X50BS型隔水式電熱恒溫培養箱上海躍進醫療器械廠；DELTA-320-S型pH計梅特勒-托利多儀器上海有限公司；WFZ UV2000型紫外分光光度計上海合利儀器有限公司；METTLER AE200型電子分析天平梅特勒-托利多儀器上海有限公司；DDSJ-308A型電導率儀上海儀電科學儀器股份有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1黃原膠寡糖琥珀酸酯衍生物制備

1.2.1.1黃原膠寡糖XG-OH制備將30g黃原膠（XG）溶于1600mL的pH為12.0的水中，并向其中加入50mL 30%H2O2，于80℃下攪拌5d，冷卻，用0.1mol/L HCl調節溶液pH至7.0，先通過微孔過濾器（0.45μm），然后在蒸餾水中透析（截流分子量為3500、7000和14000u）6d，冷凍干燥后得到黃原膠寡糖XG-OH約1.0g［6］。

1.2.1.2黃原膠寡糖琥珀酸酯衍生物SA-XG-1制備向100mL含黃原膠寡糖（XG-OH）1.0g的去離子水中，滴加50mL含琥珀酸酐0.5g的丙酮溶液，恒溫40℃，攪拌4h。產物經丙酮析出后，用丙酮溶液反復洗滌、抽濾，真空干燥后得黃原膠琥珀酸酯衍生物SA-XG-1。

1.2.1.3黃原膠寡糖琥珀酸酯衍生物SA-XG-2制備當反應時間為8h，重復1.2.1.2操作得SA-XG-2［5］。

1.2.1.4黃原膠寡糖琥珀酸酯衍生物SA-XG-3制備當琥珀酸酐量為1.0g時，攪拌4h，重復1.2.1.2操作得SA-XG-3。

1.2.2測試表征

1.2.2.1分子質量及分布測定紅外光譜在EQUNOX55傅里葉紅外-拉曼光譜儀上進行，采用溴化鉀（KBr）壓片法制樣，測定波數范圍為400～4000cm-1，分辨率為150cm-1。采用凝膠滲透色譜法（GPC）測定黃原膠降解產物的相對分子質量及其分布。

GPC測試條件如下：柱子：TOSOH BIOSEP G4000SWXL；流動相：0.2mol/L醋酸鈉溶液；色譜儀：Waters 515型凝膠色儀；檢測器：Waters2410示差折光檢測器；進樣量：50μL；柱溫：40℃。標準物質：葡聚糖，分子量分別為473000、188000、76900、43200、10500、4400u［7］。

1.2.2.2丙酮酸含量測定采用紫外分光光度法，在波長條件為320nm下對黃原膠降解產物的丙酮酸含量進行測定［8］。

1.2.2.3還原糖含量測定采用3，5-二硝基水楊酸比色法測定黃原膠降解產物中還原糖的含量［9］。

1.2.2.4取代度測定黃原膠寡糖琥珀酸衍生物SA-XG-1、SA-XG-2、SA-XG-3的取代度測定參照Sigga［10］的方法。取1.0g黃原膠寡糖琥珀酸衍生物于250mL的錐形瓶中，再加入40mL的75%乙醇，加熱到55℃并攪拌0.5h，再加入10mL 0.05mol/L濃度的NaOH溶液，皂化攪拌15min，之后用0.5mol/L HCl溶液滴定到酚酞指示劑的紅色剛好消失。用黃原膠寡糖琥珀酸酯衍生物等量的寡糖做空白。黃原膠寡糖琥珀酸酯衍生物中琥珀酸基團的含量（WMA）與取代度（DS）的計算如下［5］。

式中：W—樣品質量（g）；c—HCl溶液的濃度（mg/mL）；V0—空白組消耗HCl的體積（mL）；V—實驗組消耗HCl的體積（mL）。

1.2.3抑菌性能測定

1.2.3.1瓊脂平板打孔法測定抑菌作用用接種環挑取少許野油菜黃單胞菌菌體于20mL胰蛋白胨大豆肉湯培養基中，37℃，200r/min搖床培養12h。稀釋至終濃度106CFU/mL左右的菌懸液，備用。向平板中傾注15～20mL的營養瓊脂培養基，并搖勻。待凝固后加入0.1mL菌懸液，用無菌涂布棒涂布均勻，靜置片刻，然后在平皿中用無菌6mm牛津杯打孔，并用無菌牙簽挑出多余培養基，分別吸取0.2mL兩種濃度（10.00、5.00g/L）的三種取代度的無菌黃原膠寡糖琥珀酸酯衍生物注入已打好的孔中。于37℃下培養24h，測量抑菌圈大小。以2.00g/L的頭孢曲松鈉作陽性對照，無菌水做空白對照，平行實驗3次［11］。

1.2.3.2最低抑菌濃度（MIC）的測定配制胰蛋白胨大豆肉湯液體培養基，121℃高壓滅菌。利用胰蛋白胨大豆肉湯進行平板連續稀釋得抑菌劑的濃度分別為10.00、7.50、5.00、2.50、1.25、1.00g/L，然后在每一系列平板培養基中接種野油菜黃單胞菌，每個濃度三次平行，并置于37℃下培養24h，之后觀察生長情況。將平板利用劃線法接種、培養，觀察各實驗菌的生長情況，以平板中沒有細菌生長的最低濃度即為最低抑菌濃度MIC［12］。

1.2.3.3生長曲線測定將活化后菌落總數為106CFU/mL的野油菜黃單胞菌液以3%接種量接入含有2.50g/L黃原膠寡糖琥珀酸酯衍生物的胰蛋白胨大豆肉湯培養基中，分裝試管，分別在0、3、6、9、12、15、18、21h測定溶液OD600的值［13］。

1.2.3.4黃原膠寡糖琥珀酸酯衍生物對野油菜黃單胞菌細胞膜通透性的影響取菌落總數約為106CFU/mL的野油菜黃單胞菌液5mL與等體積濃度為5g/L的黃原膠寡糖琥珀酸酯衍生物溶液混合，使三種黃原膠寡糖琥珀酸酯衍生物濃度達到2.50g/L，于37℃、150r/min條件下振蕩培養。分別在0、20、40、60、80、100、120、140、180min時取樣，測定培養液的電導率，對照組用無菌水代替黃原膠寡糖琥珀酸酯衍生物溶液［14］。

1.2.4數據分析采用OriginPro 8作圖，并用SPSS 20.0對數據進行分析（n=3，p＜0.05）。

2　結果與分析

2.1黃原膠琥珀酸酯衍生物的結構表征

圖1是黃原膠寡糖XG-OH及取代度不同的黃原膠寡糖琥珀酸衍生物SA-XG-1、SA-XG-2和SA-XG-3的紅外譜圖。從圖1中可知，三種衍生物SA-XG-1、SA-XG-2和SA-XG-3的多數伸縮振動吸收峰與黃原膠寡糖的吻合，分別出現在1000、1600、3500cm-1處，這表明三種黃原膠寡糖琥珀酸衍生物保留了黃原膠寡糖骨架的基本結構［7］。而三種衍生物SA-XG-1、SA-XG-2和SA-XG-3在1727cm-1處出現了酯基中C= O的伸縮振動峰，表明琥珀酸酐與黃原膠寡糖發生了酯化接枝反應［7］。

GPC測試結果表明，三種黃原膠寡糖琥珀酸酯衍生物SA-XG-1、SA-XG-2、SA-XG-3相對平均分子質量分別為7560、6400、7430u。SA-XG-1、SA-XG-2、SA-XG-3的丙酮酸含量分別為4.6%、4.9%和4.9%；三種衍生物的還原糖含量分別為20.5%、19.4%和19.0%。取代度測試結果：三種黃原膠寡糖琥珀酸酯衍生物SA-XG-1、SA-XG-2、SA-XG-3的取代度分別是0.18、0.32和0.43。

圖1　黃原膠寡糖及其琥珀酸酯衍生物紅外光譜圖Fig.1　FT-IR spectra of succinyl xanthan oligosaccharides

2.2黃原膠寡糖琥珀酸酯衍生物對野油菜黃單胞菌的抑菌效果

抑菌圈測量是微生物分析的經典方法。通過測量抑菌圈的直徑，來初步判斷抑菌劑的抑菌能力。從表1可知，當抑菌劑濃度為5g/L時，SA-XG-1的抑菌圈直徑為16.83cm，大于XG-OH和其他兩種衍生物；當抑菌劑濃度增大至10g/L時，抑菌圈均有所增大，而且三種黃原膠琥珀酸酯衍生物對野油菜黃單胞菌的抑菌效果大小仍是：SA-XG-1＞SA-XG-2＞SA-XG-3，表現出隨著取代度的增加，抑菌效果減弱的現象。其中，衍生物SA-XG-1的效果優于寡糖。

表1　黃原膠寡糖琥珀酸酯衍生物對野油菜黃單胞菌的抑菌效果Table 1　The inhibitory effect of succinyl xanthan oligosaccharides against X.campestris

2.3最低抑菌濃度（MIC）測定

表2　黃原膠寡糖琥珀酸酯衍生物的最小抑菌濃度（g/L）Table 2　The MIC of succinyl xanthan oligosaccharides（g/L）

MIC是指抑菌劑能夠完全抑制細菌生長所需要的最低濃度，其值越低說明抑菌劑對細菌的抑制效果越好。三種黃原膠寡糖琥珀酸酯衍生物對野油菜黃單胞菌的最小抑菌濃度見表2，結果表明在1.25g/L時，SA-XG-1可以完全抑制野油菜黃單胞菌的生長，而SA-XG-2和SA-XG-3完全抑制野油菜黃單胞菌生長需要2.50g/L，即SA-XG-1具有最好的抑菌效果。這與抑菌圈實驗結果規律一致。

2.4黃原膠寡糖琥珀酸酯衍生物對野油菜黃單胞菌生長的影響

圖2　黃原膠寡糖琥珀酸酯衍生物對野油菜黃單胞菌生長的影響Fig.2　Antibacterial activity of succinyl xanthan oligosaccharides against X.campestris

三種黃原膠琥珀酸酯衍生物對野油菜黃單胞菌生長的抑制效果見圖2，由圖2可知，在21h內空白組OD值從坐標原點附近上升到約1.2隨后趨于平穩，加入黃原膠寡糖琥珀酸衍生物的實驗組OD值有所下降，其中加入SA-XG-1的實驗組OD值下降最為明顯。表明SA-XG-1對野油菜黃單胞菌的抑制效果最佳，且隨著取代度的升高，衍生物抑菌效果減弱，這與抑菌圈以及MIC規律一致。

2.5黃原膠琥珀酸酯衍生物對野油菜黃單胞菌細胞膜通透性的影響

圖3　黃原膠琥珀酸酯衍生物對野油菜黃單胞菌液電導率的影響Fig.3　Effect of succinyl xanthan oligosaccharides on electric conductivity of X.campestris

抑菌劑對細菌細胞膜通透性的影響是抑菌劑的抑菌機理之一。細胞膜是細菌的一層保護屏障，當細菌遇到不利生長環境或與抑菌劑作用時，其細胞膜會遭到破壞，喪失半透性，內部電解質大量滲入至培養液中，導致培養液的電導率上升。因此菌液電導率的變化反映了細菌細胞膜通透性的變化情況［15］。三種黃原膠寡糖琥珀酸酯衍生物對野油菜黃單胞菌細胞膜通透性的影響見圖3，在180min內空白組電導率由初始值上升逐漸至6.0附近，這是由于細菌細胞的自然死亡導致，加入黃原膠寡糖琥珀酸衍生物后電導率有明顯上升的趨勢。其中SA-XG-1組電導率上升的最高，即取代度最小的SA-XG-1對野油菜黃單胞菌細胞膜具有最強的破壞性，這與抑菌能力的實驗結果一致，說明黃原膠寡糖琥珀酸衍生物對細菌細胞膜的破壞是抑菌機理之一。

3　結論

黃原膠寡糖對野油菜黃單胞菌的抑菌活性與其粘度/還原末端比有關［16］。而本研究探討了黃原膠寡糖琥珀酸酯衍生物的取代度對抑菌效果的影響以及抑菌機理。將堿性條件下制得的黃原膠寡糖與琥珀酸酐反應，制得三種分子量、丙酮酸、還原糖含量相近，而取代度不同的黃原膠寡糖琥珀酸酯衍生物，通過評價它們對野油菜黃單胞菌的抑菌圈、MIC、生長曲線及細胞膜通透性影響，結果表明只有取代度最小的黃原膠寡糖琥珀酸酯衍生物比原料黃原膠寡糖有更好的抑菌效果，并且隨著取代度的提升，抑菌性能逐漸下降，這可能是由于隨著取代度的升高，黃原膠寡糖琥珀酸酯衍生物中的活性羥基數目逐漸下降，導致抑菌性能下降，相關機理還需要進一步分析實驗得出。

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Preparation of succinyl xanthan oligosaccharides and its antibacterial activities against Xanthomonas campestris

SUN Tao，XU Hong-lei，ZHOU Ke-peng，XIE Jing，XUE Bin，SHAO Ze-huai，WU Yi-fei
（College of Food Science and Technology，Shanghai Ocean University，Shanghai Engineering Research Center of Aquatic-Product Processing and Preservation，Shanghai 201306，China）

Three succinyl xanthan oligosaccharides with different substituting degrees（SA-XG-1，SA-XG-2 and SA-XG-3）were prepared.Their molecular weights determined by GPC method were 7560，6400 and 7430u，respectively.Their substituting degree was 0.18，0.32 and 0.43，respectively.The antibacterial activities of three succinyl xanthan oligosaccharides against Xanthomonas campestris（X.campestris）were investigated by the inhibition zone，minimal inhibitory concentration（MIC）and the influence on the growth of X.campestris.The influence of three succinyl xanthan oligosaccharides on electric conductivity of X.campestris was also determined.The results showed that the inhibition zone was decreased，the MIC was increased，but the damage capability to cell membrane of X.campestris was decreased with the increasing of the substituting degrees，in other words，the SA-XG-1 possessed the best antibacterial activity.The results showed that the antibacterial activity of succinyl xanthan oligosaccharides may be related to the substituting degrees，and the damage capability to cell membrane of X.campestris may be the one of the main antibacterial mechanism of succinyl xanthan oligosaccharides.

succinyl xanthan oligosaccharides；substituting degree；antibacterial activity

TS201.3

A

1002-0306（2015）12-0091-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.12.011

2014－09－23

孫濤（1970-），女，博士，副教授，研究方向：天然多糖。

“十二五”國家支撐計劃項目“鮮活農產品安全低碳物流技術與配套裝備”，淡水水產品保活冷鮮冷鏈物流關鍵技術研發（2012BAD38B04）基金資助。