超聲波對桑葚花色苷中矢車菊素穩定性的影響

馬　　琳，趙瑞潔，李京陽，賈一凡，張亞杰，陳　　健，2，*

（1.北京林業大學生物科學與技術學院食品科學與工程系，北京100083；2.北京林業大學林業食品加工與安全北京市重點實驗室，北京100083）

超聲波對桑葚花色苷中矢車菊素穩定性的影響

馬琳1，趙瑞潔1，李京陽1，賈一凡1，張亞杰1，陳健1，2，*

（1.北京林業大學生物科學與技術學院食品科學與工程系，北京100083；2.北京林業大學林業食品加工與安全北京市重點實驗室，北京100083）

為了探討在食品加工中超聲波處理對富含花色苷原材料的影響，本文以桑葚中的花色苷-矢車菊素為研究對象，研究超聲波處理對其穩定性及抗氧化活性的影響，對處理過程中羥基自由基的清除與花色苷的降解進行相關性分析。實驗結果顯示，超聲波處理會導致花色苷部分降解，且隨強度增大，花色苷穩定性明顯降低，抗氧化能力減弱。當功率由200W增加至500W，處理時間由15min增長至90min時，樣品對·OH的清除率平均下降40%；抗氧化活性下降5%～70%。

超聲波，花色苷，矢車菊素，穩定性，抗氧化活性，羥基自由基

桑葚又名桑棗、桑果、桑實、葚子、烏葚等，系桑科、桑屬植物［1］。果實有柄，橢圓形，深紫色或黑色，少有白色；花期4～5月，果期6～7月，通常于4～6月桑葚呈紅紫色時采收。質油潤，富糖性，氣微，味微酸而甜，以個大、肉厚、紫紅色、糖性大者為佳［2］。陳亮［3］研究結果表明：野生桑葚總花色苷含量為154.27mg/100g，含有的三種花色苷成分分別為矢車菊素-3-葡萄糖苷、矢車菊素-3-蕓香糖苷和天竺葵素-3-葡萄糖苷，其相對含量為67.52%、31.29%和1.06%。

花色苷是自然界最重要的一種功能性色素之一，安全、無毒，能夠保護植物抵抗蟲害以及預防植物的紫外線照射損傷，而且對人類具有許多生理保健功能，如清除體內自由基、抗腫瘤、抗脂質過氧化、保護肝臟等［4］，已被廣泛應用于食品、醫藥等行業。

超聲波指頻率高于20kHz的一種高頻機械波，其特點是頻率高、波長短、功率大、穿透力強［5］。在食品加工中利用超聲波空化效應在液體中產生的局部瞬間高溫及溫度交變變化、局部瞬間高壓和壓力變化，可使某些細菌致死、病毒失活，甚至使體積較小的微生物的細胞壁破壞，從而延長保鮮期，保持食物原有風味［6］。超聲波因其處理過程中無化學殘留、安全性高等優點，在食品加工領域得到廣泛應用，如超聲輔助提取、助濾、滅菌、鈍酶、脫氣、干燥、清洗、食品添加劑的合成、食品品質的檢測等［7-8］。然而有研究表明，超聲波在加工應用中會降低花色苷的穩定性，造成其部分降解，降低商品價值。為此，本實驗選用桑葚中含量最高的花色苷—矢車菊素為對象，探討超聲波強度及處理時間對花色苷穩定性的影響。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

桑葚購于河南洛陽孟津縣，于4℃冷藏保存；甲醇、三氟乙酸、乙酸乙酯、亞油酸分析純，國藥集團化學試劑北京有限公司；醋酸鈉、乙酸、鹽酸、六水合氯化鐵北京藍弋化學試劑公司；Tween-20LR，購于美國Sigma公司；Amberlite XAD-7樹脂北京金銳林科技發展有限公司；三吡啶-三吖嗪［1，3，5-tri（2-pyridyl）-2，4，6-triazine，TPTZ，99%］、1，1-二苯基-2-苦基肼（1，1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical，·DPPH，96%） 美國Aladdin公司；Trolox（6-hydroxy-2，5，7，8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid）（上海）化成工業發展有限公司。

Amberlite XAD-7層析柱26mm×70cm，北京普瑞因生物色譜技術有限公司；UV-1800紫外可見分光光度計上海美譜達儀器有限公司；RE-52旋轉蒸發器上海亞榮生化儀器廠；W201B恒溫水浴鍋上海申順生物科技有限公司；SHZ-Ⅲ型循環水真空泵上海知信實驗儀器技術有限公司；LD4-2低速離心機北京醫用離心機廠；AL104電子天平梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；Infinite M200多功能酶標儀瑞士Tecan公司；JAC-Ⅳ超聲波細胞粉碎機濟寧市奧波超聲波電氣有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1矢車菊素的分離采用陳健［9］的方法提取和純化桑葚花色苷中的矢車菊素。桑葚用組織搗碎機破碎后，用2L含0.5%三氟乙酸的甲醇在0℃浸提24h后4800r/min離心15min，在38℃下旋轉蒸發除去甲醇，得到花色苷提取物的濃縮液。該濃縮液用乙酸乙酯以1∶1（v∶v）的比例液液萃取3次，得到除去脂溶性成分的花色苷樣品。將粗提得到的花色苷樣品過Amberlite XAD-7柱色譜進行粗分離（洗脫溶劑為含0.5%三氟乙酸的甲醇），除去色素混合物中含有的糖、酸等雜質。旋蒸除去甲醇，得到純化后的花色苷。

1.2.2超聲波處理以100W為梯度單位，設置200～500W四個功率梯度；同時以15min為梯度單位，設置15～90min六個時間梯度，分別取5mL花色苷樣品進行超聲波處理，得到處理后的24個樣品。

1.2.3動力學分析參照K?rca和Cemerogˇlu［10］的方法，應用一級反應動力學模型分析超聲波對矢車菊素的降解過程。

ln（Ct/C0）=-k×t

t1/2=-ln0.5×k-1

式中，Ct為處理后矢車菊素在時刻t的殘留量；C0為未經處理的矢車菊素含量；k為一級反應動力學的速率常數；t1/2為矢車菊素的半數降解時間。

1.2.4清除羥自由基（·OH）能力的測定在試管中分別加入0.05%溴甲酚紫乙醇溶液0.4mL、0.1mol/L HCl 0.5mL、1.8mmol/L FeSO4溶液1.0mL，用重蒸水稀釋至刻度，搖勻，置于30℃恒溫水浴中反應8min，用比色皿，以水為參比，在420nm處測定溶液的吸光度，測定三次取平均值作為A0。同法，在加入1mmol/L FeSO4溶液后再加入0.1mol/L H2O20.5mL，測定溶液的吸光度，測定3次取平均值作為A，計算吸光度降低值（ΔA=A0-A）。

花色苷清除·OH的測定：先于試管中分別加入0.05%溴甲酚紫溶液0.4mL、0.1mol/L HCl 0.5mL、1.8mmol/L FeSO4溶液1.0mL、0.1mol/L H2O20.5mL，分別加入經過不同功率及時間處理過的樣品，做三組平行實驗，分別測定吸光度，取平均值作為AS。則花色苷實驗組對·OH的清除率D為：

D（%）=（AS-A）/ΔA×100

1.2.5鐵還原力測定參照孫建霞［11］的研究方法，配制TPTZ工作液，該工作液由2.5mL 10mmol/L的TPTZ溶液，25mL 0.3mol/L醋酸鹽緩沖液，2.5mL 20mmol/L的FeCl3組成。將樣品稀釋10倍至40μL，和260μL TPTZ工作液反應30min后，測定其在593nm處的吸光值。樣品的鐵還原能力以相當于nmol/mL Trolox的鐵還原能力表示。

Trolox標準曲線繪制：采用0.5%TFA水和甲醇（7∶3，v∶v）配制濃度為600、400、200、100、50、25nmol/L的Trolox標準溶液，分別取40μL與TPTZ工作液在相同條件下反應，測定吸光值，制作標準曲線。

1.2.6清除DPPH·能力的測定參照張燕［12］的研究方法，并稍作改進。將2.6mL 0.14mmol/L的DPPH·甲醇溶液和0.4mL樣品混合后，常溫避光條件下放置45min，在紫外分光光度計中517nm波長下測定其吸光值。設定以不加樣品的DPPH·溶液為對照，清除DPPH·的能力以相當于nmol/mL Trolox清除DPPH·的能力表示。

Trolox標準曲線：采用0.5%TFA水和甲醇（7∶3，v∶v）配制濃度為600、400、200、100、50、25nmol/L的Trolox標準溶液，分別取40μL與DPPH·工作液在相同條件下反應，測定吸光值，制作標準曲線。

1.2.7在β-胡蘿卜素-亞油酸體系中的作用準確稱量5mg β-胡蘿卜素，溶于10mL的氯仿中，再加入0.25mL的亞油酸和2.0mL的Tween-20，混合均勻后移入圓底瓶中，于50℃旋轉蒸發4.0min，然后加入500mL蒸餾水備用，作為反應液；同時準確稱取VC，配成0.5mg/mL的VC溶液作為對照；將不同處理后的桑葚花色苷樣品稀釋，作為待測液。向各試管中分別加入1.0mL不同的待測液和4.0mL反應液，于50℃水浴中反應，每隔25min測其在470nm處的吸光度A（分別在不同的待測液構成的體系中，以蒸餾水代替β-胡蘿卜素作為空白調零），共測量150min，抗氧化能力按下列公式計算［13］：

抗氧化能力（%）=［1-（A0-At）/（A0’-At’）］×100

其中，A0和At分別為加入樣品后0min和150min時的吸光度；A0’和At’分別為不加樣品時0min和150min時的吸光度。

2　結果與討論

2.1動力學分析

對花色苷降解過程進行動力學模型分析可用于預測加工過程花色苷降解速度，從而減少花色苷的損失，有利于控制食品的品質。根據文獻報道［13-14］，諸多因素都會對花色苷穩定性產生影響，許多學者根據不同因素應用不同模型對花色苷降解過程進行了模擬，發現花色苷在不同的條件下，符合的降解動力學模型也不同，主要可分為零級、一級、二級和復雜反應動力學。孫建霞［11］發現高壓脈沖電場（PEF）降解矢車菊素-3-葡萄糖基（Cy-3-glc）和矢車菊素-3-槐糖苷（Cy-3-soph）符合一級反應動力學。

圖1　超聲波降解矢車菊素的動力學分析Fig.1　Kinetics analysis of cyanidin after ultrasonic treatment

本實驗超聲波處理中功率、時間與矢車菊素的降解關系如圖1所示，隨著處理功率的增大和時間的延長，ln（Ct/C0）減小，矢車菊素的含量減少，即矢車菊素的保留率顯著（p＜0.05）降低，表明矢車菊素發生了顯著降解（p＜0.05）。超聲波降解矢車菊素符合一級反應動力學（R2均在0.91以上）。超聲波降解矢車菊素的動力學參數如表1所示。

表1　超聲波降解矢車菊素的動力學參數Table 1　Kinetics parameters of Cyanidin degradation exposed to ultrasonic wave

由表1的動力學參數發現，200W時降解速率常數只有1.34×10-2min-1，半數降解時間為51.7274min，而當功率增大到500W時，降解速率常數迅速升至5.89× 10-2min-1，半數降解時間也急速降至11.7682min。

本實驗中超聲波對花色苷的影響主要為空化作用，空化作用產生高溫、高壓，促使水分子裂解為自由基，自由基由于含有未配對電子，性質非常活潑，具有強氧化性，進一步促進了花色苷的降解。水分子裂解為自由基需要很大的能量，較低功率狀態下超聲波脈沖的能量較小，因此產生的自由基比較少，從而矢車菊素保留率較高，降解速率較小。

2.2清除羥自由基（·OH）能力的測定

圖2　·OH清除率與超聲波功率、時間的關系Fig.2　The correlation between clearance rate of·OH and ultrasonic power and treatment time

由圖2可以看出，相同功率的超聲波條件下，隨著超聲時間的增長，矢車菊素清除·OH的能力逐漸下降，且功率越大，這種影響越強烈。如200W條件下清除自由基能力下降曲線十分平緩，而500W時則變化非常明顯（p＜0.05），處理時間為90min時清除·OH的能力已經下降到7.8%，幾乎已經失去了清除自由基的能力。當功率由200W增加至500W，處理時間由15min增長至90min時，樣品對·OH的清除率平均下降40%。

雖然本實驗中Fenton法會產生·OH，但是由于每一組工作液中產生的·OH的量相同，且在計算中已經扣除，因此對總趨勢并不產生影響。

綜上可以得到結論，超聲波處理會使矢車菊素清除·OH的能力下降，且變弱程度與超聲波功率及處理時間有一定相關性。產生這種現象的原因是超聲波的空化作用使小分子裂解產生的·OH會對矢車菊素進行攻擊，導致矢車菊素遭到破壞，喪失了清除自由基能力，因此清除·OH能力下降，超聲波處理的強度越大，這種破壞就越嚴重。

2.3抗氧化活性分析

目前有很多方法可以評價體系的抗氧化能力，不同的方法也基于不同的原理，但是在評價一種復雜體系的抗氧化能力時，沒有一種評價方法能夠代替其他所有的方法并且做到全面而準確［15］。FRAP和DPPH兩種方法具有快速、簡便、靈敏和重復性好等優點［16］，而β-胡蘿卜素-亞油酸法的優點是只使用少量的樣品和試劑，重現性好，對脂溶性樣品測定效果好［17］。所以，本實驗結合了FRAP、DPPH和樣品在β-胡蘿卜素-亞油酸體系中的抗氧化作用三種方法來綜合評價經過超聲波處理降解花色苷后抗氧化活性的變化。

2.3.1FRAP、DPPH結果分析經超聲波處理后矢車菊素溶液體系的FRAP和DPPH·活性變化如圖5所示，其中（a）、（b）為鐵還原能力測定結果，（c）、（d）為清除DPPH·自由基能力測定結果。

參照圖5（a）、圖5（b）兩圖，與對照相比，經過超聲波處理后的矢車菊素溶液體系抗氧化活性均降低，在大功率、長時間作用下，這種趨勢更加顯著（p＜0.05）。當處理時間只有15min時，樣品的鐵還原力僅僅下降了5%～25%，而當時間延長至90min時，鐵還原力最大下降了71.833%。而在同樣的處理時間下，當超聲波功率增大，鐵還原力下降程度越大。當處理時間均為90min時，隨功率由200W增大到500W，鐵還原力下降程度由22.113%增加到71.833%，增加十分明顯（p＜0.05）。由此可知，超聲時間的延長以及超聲功率的增大會導致矢車菊素降解程度加強。

參照圖5（c）、圖5（d）兩圖，與對照相比，經過超聲波處理后的矢車菊素溶液體系抗氧化活性均呈降低趨勢。當超聲波處理功率一定時，隨著處理時間的延長，清除DPPH·自由基能力下降越來越明顯。如超聲波處理功率在500W時，隨著時間由15min延長至90min，樣品清除DPPH·自由基能力下降程度從22.989%增大至38.604%，下降極顯著（p＜0.01）。同時，在處理時間一定時，當超聲功率增大，清除DPPH·自由基能力下降百分比變化極顯著（p＜0.01）。如當處理時間均為90min時，隨功率由200～500W，清除DPPH·自由基能力下降程度由21.611%增大到38.604%，下降較為明顯。

圖3　Trolox在593nm處標準曲線（FRAP）Fig.3　Correlation between Trolox content and the absorbance at 593nm（FRAP）

圖4　Trolox在517nm處標準曲線（DPPH·）Fig.4　Correlation between Trolox content and the absorbance at 517nm（DPPH·）

圖5　超聲波處理對矢車菊素的FRAP（a，b）、DPPH·（c，d）抗氧化活性影響Fig.5　Effect of ultrasonic treatment on the the antioxidant activities of cyanidin measured by FRAP（a，b），DPPH·（c，d）

綜上所述，由于超聲時間的延長及功率增大，即長時間、高能量的作用，超聲造成的空化作用加強，促使更多的水分子裂解，產生更多的性質活潑、具強氧化性的自由基，從而促進花色苷降解。由此得到結論，隨著超聲波處理時間的延長以及功率的增大，矢車菊素的抗氧化活性下降更加明顯。

2.3.2在β-胡蘿卜素-亞油酸體系中的抗氧化作用圖6表明，處理功率與時間都會影響花青素的β-胡蘿卜素抗氧化活性。隨著處理時間的延長，抗氧化能力呈下降趨勢，特別是200W功率下，下降趨勢變化顯著（p＜0.05）。同時超聲波功率也會對體系中的抗氧化能力產生影響，功率越大，抗氧化能力越弱。超聲波處理的功率和時間對抗氧化能力有相同的影響趨勢，低功率和短時間抗氧化能力的影響都較小。而當功率一旦增大到300W，時間延長至60min時，抗氧化能力明顯減弱（p＜0.05）。同時還發現，所有處理后的花青素溶液的抗氧化能力都要顯著高于VC溶液（p＜0.05）。

Effects of ultrasonic wave treatment on stabilities of cyanidin from mulberry

MA Lin1，ZHAO Rui-jie1，LI Jing-yang1，JIA Yi-fan1，ZHANG Ya-jie1，CHEN Jian1，2，*
（1.Department of Food Science，College of Biological Sciences and Biotechnology，Beijing Forestry University，Beijing 100083，China；2.Beijing Forestry University，Key Laboratory of Forestry Food Processing and Security，Beijing 100083，China）

In order to investigate the influence of ultrasonic treatment in food processing for raw materials rich in anthocyanin，in this research，cyanidin from mulberry extracts were used as materials.The effects of ultrasonic waves on cyanidin stabilities and antioxidant activity were investigated.Further，the relation between the hydroxyl radical scavenging and anthocyanin degradation in ultrasonic treatment was analyzed.Experimental results showed that the ultrasonic treatment could lead to partial degradation of anthocyanins.With the intensity increasing，the stability of anthocyaninsin significantly reduced and antioxidant capacity was weakened.When the ultrasonic power was increased from 200W to 500W，processing time increased from 15min to 90min，the scavenging rate to·OH of the sample decreased by 40%on average and antioxidant activity decreased by 5%～70%.

ultrasonic waves；anthocyanin；cyanidin；stability；antioxidant activity；hydroxyl radicals

TS255.36

A

1002-0306（2015）12-0138-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.12.020

2014-08-29

馬琳（1993-），女，大學本科，研究方向：天然產物的提取與利用。

陳健（1985-），男，講師，研究方向：天然產物的提取與利用。

中央高校基本科研業務費專項資金資助（xs2014020）。