吲哚乙酸對冬蟲夏草生物量、胞外多糖產量及其抗氧化性能的影響

張志紅，吳素蕊，邰麗梅，樊　建，趙天瑞，*

（1.昆明理工大學云南省食品安全研究院，云南昆明650500；2.中華全國供銷合作總社昆明食用菌研究所，云南昆明650223）

吲哚乙酸對冬蟲夏草生物量、胞外多糖產量及其抗氧化性能的影響

張志紅1，吳素蕊2，邰麗梅2，樊建1，趙天瑞1，*

（1.昆明理工大學云南省食品安全研究院，云南昆明650500；2.中華全國供銷合作總社昆明食用菌研究所，云南昆明650223）

通過在液體培養基中添加不同濃度的吲哚乙酸，研究吲哚乙酸對冬蟲夏草生物量、胞外多糖產量及其抗氧化性能的影響。結果表明：適宜濃度的吲哚乙酸可以提高冬蟲夏草的生物量和胞外多糖產量，并且隨吲哚乙酸濃度的增加二者均呈先增后降的變化趨勢，當濃度為2.5μg/mL時，生物量和胞外多糖產量均達到最高，分別為18.3g/L和2.9g/L，較不添加吲哚乙酸分別增加了6.3%和15.4%；同時，適宜濃度的吲哚乙酸還可以提高冬蟲夏草胞外多糖的抗氧化性能，在1.0μg/mL和2.5μg/mL時，胞外多糖對羥基自由基和DPPH的清除率分別達到最高，為58.9%和56.6%。

冬蟲夏草，吲哚乙酸，生物量，胞外多糖，抗氧化

冬蟲夏草［Cordyceps sinensis（Berk.）Sacc.］又名蟲草，隸屬于真菌門（Eumycota）、子囊菌亞門（Ascomycotina）、核菌綱（Pyrenomycetes）、麥角菌目（Clavicipitales）、麥角菌科（Clavicipitaceae）、蟲草屬（cordyceps）［1］。冬蟲夏草是蟲草菌寄生于蝙蝠蛾（Hepialus armoricanus）等昆蟲幼體內形成的菌物復合體，是一種極其名貴的中草藥［2］，主要分布在我國青海、西藏、四川、云南等地海拔3000～5100m的高寒草甸區［3］。傳統中醫認為，冬蟲夏草性溫和、味甘后微辛，具有止血化痢、補精益髓、益腎、保肺、止癆咳等功效［4］。現代醫學研究表明，冬蟲夏草具有免疫調節、抗癌、調節內分泌、抗菌、促進造血、抗病毒、護肝以及抗驚厥等生理活性作用［5］，具有很高的研究利用價值。

目前，關于植物激素在促進植物細胞生長發育等方面的作用已經有了比較全面的認識［6］。近年來，關于植物激素對于食用菌的作用影響也時見報道，如據上官端琳等［7］報道，適當濃度的α-萘乙酸可以提高黑脈羊肚菌的生物量和胞內多糖產量。據王謙等［8］報道，赤霉素能有效提高金福菇菌絲的生長速度，當濃度為1.0mg/L時，生長速度提高達15.77%。據馬榮山等［9］報道，α-萘乙酸能較好地促進草原白磨菌絲體的生長。然而，植物激素類物質對冬蟲夏草的作用影響卻鮮見報道。吲哚乙酸作為植物激素類物質，不僅能夠促進細胞的分裂和伸長，使細胞的生物量增加，還可以調節細胞的代謝活動，促進代謝產物的合成。因此，本實驗選取吲哚乙酸為實驗材料，研究了吲哚乙酸對冬蟲夏草生物量、胞外多糖產量及其抗氧化性能的影響，以期為進一步開發利用蟲草資源提供理論與實踐依據。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

冬蟲夏草菌由昆明食用菌研究所提供；葡萄糖、蛋白胨、酵母膏、瓊脂、KH2PO4、MgSO4·7H2O、吲哚乙酸（IAA） 均購自昆明鼎國生物技術有限公司；苯酚、乙醇、H2SO4、DPPH、FeSO4·7H2O、水楊酸、H2O2、甲醇等其他試劑均為國產分析純。

BSC-250型恒溫恒濕培養箱上海博訊實業有限公司醫療設備廠；QYC-2102C型光照振蕩培養箱寧波江南儀器廠；TU1901型雙光束紫外可見分光光度計北京普析通用儀器有限責任公司；TGL-16G型離心機上海安亭科學儀器廠；ES-315型高壓滅菌鍋TOMY KOGYO CO.LTD；AL204型分析天平梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；ZD-F12型真空冷凍干燥機南京載智自動化設備有限公司；N-1100型旋轉蒸發儀上海愛朗儀器有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1培養基配制PDA培養基：馬鈴薯20%，葡萄糖2%，瓊脂2%，pH自然；液體培養基：葡萄糖4%，酵母膏1%，蛋白胨0.5%，KH2PO40.1%，MgSO4·7H2O 0.05%，pH自然。液體培養基按比例配制好后，按每瓶100mL的裝液量分裝，于121℃高壓滅菌30min。

1.2.2接種與培養菌種活化：將實驗所需菌株接種到PDA培養基上，18℃恒溫恒濕培養14d，4℃冰箱保藏備用。

發酵培養：為防止高溫使IAA失活，因而在接種前將濾菌后的IAA乙醇溶液按實驗設定的濃度加入到液體培養基中，每個水平做3個平行實驗。將活化好的菌種分別接種到含有不同濃度（0、1.0、2.5、5.0、7.5、10μg/mL）IAA的液體培養基中，接種量為6個帶菌瓊脂塊（約0.1cm2/塊）。完成后，將其置于振蕩培養箱中，在25℃，180r/min條件下培養7d。

1.2.3生物量的測定發酵結束后，將發酵液離心，棄上清液，得菌絲體，用蒸餾水反復洗滌3～4次，5000r/min離心10min后凍干，測菌絲體干重。

1.2.4胞外多糖的提取參照朱朝陽等［10］的方法稍作修改，提取胞外多糖。發酵液在5000r/min的條件下離心10min，取上清液，并將其真空濃縮至原體積的1/4，加入其3倍體積的95%的乙醇進行醇沉，4℃靜置過夜，5000r/min離心10min，棄上清液，再用75%的乙醇洗滌2～3次，5000r/min離心10min，取沉淀凍干，得粗多糖。

1.2.5胞外多糖含量的測定將粗多糖溶解，并稀釋至合適的倍數，采用苯酚-硫酸法［11］測定其吸光度，根據標準曲線計算多糖含量。

葡萄糖標準溶液的配制：準確稱取干燥的葡萄糖1.0000g置于100mL容量瓶中，用蒸餾水溶解，定容至刻度，配制成10mg/mL的葡萄糖標準溶液，搖勻備用。

葡萄糖標準曲線的繪制：準確吸取葡萄糖標準溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，分別置于20mL的比色管中，加蒸餾水稀釋至2.0mL，以蒸餾水為空白對照，分別加入6%的苯酚溶液1.0mL，迅速加入濃硫酸5mL，混勻，沸水浴15min后，用冷水冷卻。于490nm波長處，測吸光值A，以葡萄糖濃度為橫坐標，吸光值A為縱坐標繪制葡萄糖標準曲線，得回歸方程：

y=5.4387x-0.0378（R2=0.9994）

1.2.6胞外多糖抗氧化性能的測定將在不同濃度IAA作用下，發酵所得的冬蟲夏草胞外多糖分別配制成2mg/mL的多糖溶液，在測定羥基自由基清除能力和DPPH自由基清除能力時，分別按濃度梯度（0.4、0.8、1.2、1.6、2.0mg/mL）和（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/mL）進行稀釋，以測定其體外抗氧化性能。

1.2.6.1羥基自由基清除能力測定參照Smirnoff［12］的方法稍作修改，在10mL離心管中分別加入9.0mmol/L FeSO4溶液1mL，1mL樣品溶液，9.0mmol/L H2O21mL，搖勻后靜置10min，加入9.0mmol/L水楊酸-乙醇溶液1mL，搖勻，37℃保溫30min，冷卻，3000r/min離心10min，取上清液于510nm處，測吸光值Ax。為去除多糖本身對吸光值的影響，以等體積蒸餾水代替水楊酸為樣品對照組，測吸光值Ax0；以等體積蒸餾水代替多糖為空白對照組，測吸光值A0。計算公式如下：

1.2.6.2DPPH自由基清除能力測定參照Blois［13］的方法稍作修改，配制2mmol/L DPPH甲醇溶液并避光保存，取1mL待測樣液加入2mL上述DPPH溶液，充分混勻，25℃恒溫避光反應30min，在517nm處測定吸光值Ax；以等體積的甲醇溶液代替DPPH甲醇溶液作為樣品對照組，測吸光值Ax0；以等體積蒸餾水代替樣品溶液作為空白對照組，測吸光值A0。計算公式如下：

1.3數據處理

采用軟件Origin 8.0及相關方法對實驗數據進行處理和分析。

2　結果與討論

2.1不同濃度IAA對冬蟲夏草生物量的影響

不同濃度IAA作用下的冬蟲夏草生物量結果如圖1所示。

由圖1可知，在0～10μg/mL范圍內，隨著IAA濃度的增加，冬蟲夏草菌絲量呈現出先增后降的變化趨勢，在2.5μg/mL時菌絲體干重達到最大，為18.3g/L，較不添加IAA增加了6.3%；同時，當IAA濃度＞5.0μg/mL時，冬蟲夏草的生長受到抑制，并隨其濃度的增加而明顯增強。結果表明，適宜濃度的IAA可以促進冬蟲夏草生物量的增加，并隨IAA濃度的增加而呈現先增后減的變化趨勢，但過高濃度的IAA會對冬蟲夏草的生長產生明顯的抑制作用。

IAA屬于生長素類激素，能夠活化細胞質膜上的質子泵，將細胞質中的H+泵到細胞壁內，使細胞壁基質酸化，細胞壁變松弛，可塑性增強，促進細胞的伸長，從而使細胞的體積和重量增加［14］。因此，適宜濃度的IAA可以促進冬蟲夏草生物量的增加。然而，不同的生物對生長素類激素具有不同的濃度適應范圍，濃度過高會刺激細胞產生乙烯，引起細胞的老化和死亡［15］。所以，過高濃度的IAA會對冬蟲夏草的生長產生明顯的抑制作用。

2.2不同濃度IAA對冬蟲夏草胞外多糖產量的影響

不同濃度IAA作用下得到的胞外粗多糖含量結果如圖2所示。

圖1　不同IAA濃度對冬蟲夏草生物量的影響Fig.1　Effect of different concentration of IAA on mycelial biomass

圖2　不同IAA濃度對冬蟲夏草胞外多糖產量的影響Fig.2　Effect of different concentration of IAA on EPS production

由圖2可知，在0～10μg/mL范圍內，隨著IAA濃度的增加，冬蟲夏草胞外多糖產量呈現出先增后降的變化趨勢，在2.5μg/mL時胞外多糖產量達到最大，為2.9g/L，較不添加IAA增加了15.4%；同時，在0～10μg/mL范圍內，較不添加IAA的空白組，胞外多糖的產量均有不同程度的提高。結果表明：在0～10μg/mL范圍內，IAA可以促進冬蟲夏草胞外多糖產量的提高，并且隨IAA濃度的增加還會呈現出先增后減的變化趨勢。

一方面，IAA可以通過Jak2、IRS、PI3K通道作用于脂肪細胞，促進葡萄糖轉運，加速葡萄糖向糖原的轉化［16］，從而提高了冬蟲夏草多糖的產量；另一方面，IAA可以使細胞壁軟化和松弛，體積增大，細胞的可塑性和滲透性增強，導致了冬蟲夏草胞外多糖的分泌量增加［14，17-18］。同時，過高濃度的IAA會刺激細胞產生乙烯，使細胞老化死亡［15］，使多糖的產量降低，胞外多糖分泌量相應減少，因而冬蟲夏草胞外多糖的產量會隨IAA濃度的增加而呈現先增后降的趨勢。

2.3IAA對冬蟲夏草胞外多糖羥基自由基清除能力的影響

不同濃度IAA作用下，發酵所得的冬蟲夏草胞外多糖羥自由基清除能力結果如圖3所示。

圖3　冬蟲夏草胞外多糖的羥基自由基清除能力Fig.3　The scavenging effect on Hydroxyl radical of EPS from Cordyceps sinensis

由圖3可知，不同濃度IAA作用下得到的冬蟲夏草胞外多糖對羥基自由基的清除能力均隨多糖濃度的增加而增強；在相同多糖濃度下，隨著IAA濃度的增加，胞外多糖對羥基自由基的清除能力呈下降趨勢，但其清除能力較不添加IAA的空白組更強。當IAA濃度為1.0μg/mL時，冬蟲夏草胞外多糖對羥基自由基的清除能力最強，在多糖濃度為2.0mg/mL時清除率可達58.9%。結果表明，IAA可以提高冬蟲夏草胞外多糖的羥基自由基清除能力，但其清除能力隨IAA濃度的增加而呈現下降趨勢。

2.4IAA對冬蟲夏草胞外多糖DPPH清除能力的影響

不同濃度IAA作用下，發酵所得的冬蟲夏草胞外多糖DPPH清除能力結果如圖4所示。

圖4　冬蟲夏草胞外多糖的DPPH清除能力Fig.4　The scavenging effect on DPPH of EPS from Cordyceps sinensis

由圖4可知，不同濃度IAA作用下得到的冬蟲夏草胞外多糖對DPPH的清除能力均隨多糖濃度的增加而增強；在相同多糖濃度下，隨著IAA濃度的增加，胞外多糖對DPPH的清除能力呈現出先增后降的變化趨勢。當IAA濃度為2.5μg/mL時，冬蟲夏草胞外多糖對DPPH的清除能力最強，在多糖濃度為1.0mg/mL時清除率可達56.6%。結果表明，添加適當濃度的IAA可以提高冬蟲夏草胞外多糖的DPPH清除能力，并且隨IAA濃度的增加還會呈現出先增后降的變化趨勢。

3　結論

適宜濃度的IAA可以提高冬蟲夏草的生物量和胞外多糖產量，并且隨著IAA濃度的增加還會呈現先增后降的變化趨勢，但過高濃度的IAA會對冬蟲夏草的生長產生明顯的抑制作用。其中，當IAA濃度為2.5μg/mL時，冬蟲夏草的生物量和胞外多糖產量均達到最高，分別為18.3g/L和2.9g/L，較不添加IAA分別增加了6.3%和15.4%。

IAA可以提高冬蟲夏草胞外多糖的抗氧化能力。隨著IAA濃度的增加，冬蟲夏草胞外多糖對羥基自由基的清除能力呈下降趨勢，而對于DPPH的清除能力卻呈先增后降的變化趨勢。當IAA濃度為1.0μg/mL和2.5μg/mL時，胞外多糖對羥基自由基和DPPH的清除率分別達到最高，為58.9%和56.6%。冬蟲夏草胞外多糖抗氧化能力的提高，可能是由于IAA的加入改變了多糖的合成方式，導致多糖的空間結構改變或抗氧化活性高的多糖所占比例增加，從而使冬蟲夏草胞外多糖表現出更好的抗氧化性能，但具體原因有待進一步的研究分析。

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Effects of indole acetic acids（IAA）on biomass，extracellular polysaccharide production and antioxidant activity of Cordyceps sinensis（Berk.）Sacc.

ZHANG Zhi-hong1，WU Su-rui2，TAI Li-mei2，FAN Jian1，ZHAO Tian-rui1，*
（1.Yunnan Institute of Food Safety，Kunming University of Science and Technology，Kunming 650500，China；2.Kunming Edible Fungi Institute of All China Federation of Supply of Marketing Cooperative，Kunming 650223，China）

The effect of indole acetic acids（IAA）on biomass，extracellular polysaccharide（EPS）production and antioxidant activity of Cordyceps sinensis were studied in the present work.The results showed that the reasonable concentration of IAA could increase biomass and EPS production of Cordyceps sinensis.Biomass and EPS production were increased first and then decreased with the increase of IAA.Both of biomass and EPS production reached the highest content at 2.5μg/mL IAA，namely 18.3g/L and 2.9g/L，increased 6.3%and 15.4%comparing no IAA，respectively.The appropriate concentration of IAA could also improve the antioxidant activity of EPS.The strongest scavenging effect on hydroxyl radical and DPPH of EPS were 58.9%and 56.6% at the concentrations of 1.0μg/mL and 2.5μg/mL，respectively.

Cordyceps sinensis；IAA；biomass；EPS；antioxidant activity

TS201.1

A

1002-0306（2015）12-0181-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.12.029

2014－08－27

張志紅（1989-），男，碩士研究生，研究方向：發酵工程。

趙天瑞（1964-），男，大學本科，副教授，主要從事食品科學與工程方面的研究。

國家科技支撐計劃課題（2013BAD16B01）。