響應面法優化臭氧與紫外復合處理枸杞干果殺菌工藝

龔　媛，劉敦華，曲云卿，廖若宇，徐夢霞

（寧夏大學農學院，寧夏銀川750021）

響應面法優化臭氧與紫外復合處理枸杞干果殺菌工藝

龔媛1，劉敦華2，*，曲云卿3，廖若宇3，徐夢霞3

（寧夏大學農學院，寧夏銀川750021）

以枸杞干果為原料，采用臭氧與紫外復合處理進行殺菌，通過響應面分析優化確定出臭氧與紫外復合處理枸杞殺菌的最佳工藝條件為：輻射距離31cm、處理時間32min、臭氧濃度31mg/m3，在此工藝條件下測得臭氧紫外復合處理殺菌率為99.999%，在最佳工藝條件下處理對枸杞干果品質無顯著影響（p＞0.05），表明臭氧與紫外復合作用在殺菌方面具有一定的優勢。本文為寧夏枸杞微生物降解提供了科學的數據和有效的技術手段。

枸杞，臭氧與紫外復合處理，殺菌率

隨著生活水平的提高，人們越來越注重保健，醫學證明枸杞具有保護肝臟、抗氧化、降血糖、降血脂、抗腫瘤等作用［1-2］，但因市售枸杞干果的微生物超標等問題，枸杞的質量問題備受關注。因此探尋一種方法以解決超標問題是非常有必要的。

降解果蔬表面微生物主要方法有：臭氧降解、紫外降解、微波降解、微生物降解等。臭氧是一種不穩定伴有特殊氣味的氣體，具有強氧化性，中間不產生有害產物，單個的氧原子具有極強的氧化性，其強的氧化作用能殺滅多種致病微生物，而多余的氧原子在30min后又會轉化成穩態的氧分子，不會產生有毒有害的殘留物［3-5］。紫外降解微生物、農藥殘留主要利用短波紫外線（254nm）的作用，是能量作用最強的紫外線，一般用來殺死細菌和病毒［6］，但會產生細菌增殖等問題［7］。單獨使用臭氧處理含有水的食品，可能會產生致突變物，會影響人類健康，并且對枸杞干果的殺菌效果也不明顯。而臭氧-紫外光輻射聯用法（O3/UV）法的氧化過程首先是液相臭氧在紫外光輻射下分解產生OH自由基，再由OH自由基氧化水中的污染物［8］，大大提高了難氧化物質的氧化速率。

本研究以枸杞干果為原料，采用臭氧紫外復合處理進行殺菌，通過響應面分析優化確定出臭氧與紫外復合處理枸杞干果殺菌效果的最佳工藝條件，以期為寧夏枸杞微生物降解提供了科學的數據和有效的技術手段。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

枸杞干果寧夏銀川同心路市場，寧杞1號，水分：11.5874%。

AL204型電子天平梅勒-勒托利多儀器（上海）有限公司；AB-K-Y-10型移動式臭氧發生器南京奧坂干燥設備廠；DZF-6020型真空干燥箱、DNP-9052型電熱恒溫培養箱、JH-SCA型超凈工作臺上海鴻都電子科技有限公司；GJWS-A2型溫濕度表天津市津南區工藝美術陶瓷廠；7230G可見分光光度計上海精密科技有限公司；EST-10-03型臭氧濃度檢測儀深圳市源恒通科技有限公司；20W雙端雙針石英紫外線殺菌消毒燈東海縣創新燈具廠；PW103型空氣加濕器上海奔騰企業有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1枸杞殺菌流程在密封的4m2無菌室里用（智能檔）加濕器加濕使室內濕度達到實驗所需濕度，將準確稱取500g枸杞干果置于已殺過菌篩子中，關門，通入臭氧。當里面的臭氧濃度穩定時，關閉臭氧發生器，打開紫外燈，進行殺菌，殺菌結束后迅速將枸杞干果烘干裝入無菌自封袋中，并封口，置于超凈工作臺中進行微生物檢測。

1.2.2單因素實驗設計分別考察輻射距離、輻射時間、臭氧濃度、臭氧處理時間以及相對濕度各因素對臭氧與紫外復合處理枸杞干果殺菌率的影響，并對數據進行方差分析，確定各因素的適宜條件。

分別選取輻射距離30cm，輻射時間40min，臭氧濃度12.72mg/m3，臭氧處理時間30min，相對濕度90%的條件下，考察不同紫外輻射距離（10、20、30、40、50、60cm）、紫外輻射時間（20、30、40、50、60、90min）、臭氧濃度（0、6.36、12.72、25.44、38.16mg/m3）、臭氧處理時間（20、30、40、50、60min）、相對濕度（50%、60%、70%、80%、90%、95%）對臭氧與紫外復合處理枸杞干果殺菌效果的影響。

1.2.3響應面實驗設計根據單因素實驗結果，采用Box-Behnken Design（BBD）實驗設計擬合出多項回歸模型并進行方差分析，確定出臭氧與紫外復合處理枸杞干果最大殺菌率的最優工藝條件。

在單因素實驗結果的基礎上選取單因素的最佳條件：輻射距離30cm、處理時間40min、臭氧濃度25.44mg/m3作為自變量，殺菌率（Y）作為響應值，根據Box-Behnken Design（BBD）實驗設計原理，設計三因素三水平的響應面實驗（見表1）。

表1　BBD設計因素水平表Table 1　Factors and levels in the BBD design

1.2.4枸杞干果微生物降解前后品質變化測定根據SNT 0878-2000《進出口枸杞子檢驗規程》測定臭氧與紫外復合處理后的枸杞干果的理化指標、微生物指標。

1.2.5微生物測定根據GB47892-2010《食品微生物學檢驗菌落總數測定》測定細菌總數；SNT 0169-2010《進出口食品中大腸菌群、糞大腸菌群和大腸桿菌檢測方法》測定大腸菌群數。

1.2.6殺菌率計算公式

殺菌率（%）＝（殺菌前菌落總數-殺菌后菌落總數）/殺菌前菌落總數×100

1.2.7理化指標的測定水分：GB 5009.3《食品中水分的測定》直接干燥法；灰分：GB 5009.4《食品中灰分的測定》；總糖：GB 18672-2014《枸杞》；蛋白質：GB 5009.5《食品中蛋白質的測定》；脂肪：GB 5009.6《食品中脂肪的測定》。

1.2.8大腸菌群檢測根據響應面實驗優化出最佳工藝條件處理枸杞干果后，對其大腸菌群數進行檢測。

2　結果與分析

2.1單因素實驗

2.1.1輻射距離對枸杞干果殺菌率的影響由圖1可知，隨著輻射距離的減小，臭氧紫外復合處理對枸杞干果的殺菌率逐漸增大，并且輻射距離越近，紫外線更易被生物體吸收，并直接作用于微生物的遺傳物質DNA，使DNA結構遭到破壞，而使微生物不能繁殖生長，從而使殺菌率增大；方差分析表明，不同輻射距離之間，殺菌率呈現明顯的差異性（p＜0.05），輻射距離在10、20、30cm之間差異不太明顯，但輻射距離太近會影響枸杞干果的品質［9］，所以輻射距離選取的最佳范圍是20～30cm。

圖1　輻射距離對枸杞干果殺菌率的影響Fig.1　Influence of radiation distance on sterilization efficiency of dried Lycium barbarum L.

2.1.2輻射時間對枸杞干果殺菌率的影響由圖2可知，隨著紫外線輻射時間的延長，臭氧紫外復合處理對枸杞干果的殺菌率逐漸增大，紫外輻射時間越長，紫外線對微生物DNA結構破壞的更徹底，微生物不能合成蛋白質和酶而死亡，從而提高了殺菌率。方差分析結果表明，當輻射時間大于40min時殺菌率達97%以上，60～90min時，殺菌率無明顯差異（p＞0.05），并且在90min時，殺菌率達到99.99%，考慮到紫外長時間作用枸杞干果對其品質的影響，所以輻射時間的最佳范圍50～60min。

2.1.3臭氧濃度對枸杞干果表面微生物殺菌率的影響由圖3及方差分析可知，隨著臭氧濃度的增大，臭氧紫外復合處理枸杞干果的殺菌率逐漸增大，在低濃度范圍內，不同臭氧濃度對枸杞干果殺菌率的影響存在著顯著差異，高濃度的臭氧對枸杞干果殺菌率的影響無明顯差異（p＜0.05），臭氧殺菌是通果破壞細胞膜成分，改變細胞膜通透性，阻止菌體新陳代謝從而達到殺菌的作用，臭氧濃度越高，阻止菌體新陳代謝的效果越好，殺菌效果也就越明顯，但高濃度的臭氧會對人體和大氣造成很大的危害，所以臭氧濃度的最佳范圍為12.72～38.17mg/m3。

2.1.4臭氧處理時間對枸杞干果殺菌率的影響由圖4可知，隨著臭氧處理時間的延長，臭氧紫外復合處理對枸杞干果的殺菌率逐漸增高，方差分析表明，在50min之前不同臭氧處理時間的殺菌率存在著顯著差異（p＜0.05），這是因為一定濃度的臭氧破壞微生物細胞膜的成分，阻止菌體新陳代謝，臭氧會隨處理時間的延長繼續滲透于菌體內部使其死亡，本實驗臭氧處理時間在50min以上，殺菌率無顯著性差異，綜合考慮，臭氧處理時間范圍是30～60min。

2.1.5相對濕度對枸杞干果殺菌率的影響由圖5可知，隨著室內相對濕度的增加，臭氧紫外復合處理枸杞干果的殺菌率總體呈上升的趨勢，說明增加相對濕度可以提高臭氧紫外復合處理的殺菌率，這與國內外相關報道一致［10-11］。主要是因為濕度越大，微生物細胞膜因膨脹而變薄，其組織更易被臭氧破壞。方差分析可知，相對濕度對殺菌率的影響極顯著（p＜0.01），當相對濕度大于90%時，殺菌率無明顯差異，根據文獻［12］，相對濕度越高殺菌效果越明顯，此實驗相對濕度最佳取值應為90%±5%。

圖2　輻射時間對枸杞干果殺菌率的影響Fig.2　Influence of radiation time on sterilization efficiency of dried Lycium barbarum L.

圖3　臭氧濃度對枸杞干果殺菌率的影響Fig.3　Influence of the ozone concentration on sterilization efficiency of dried Lycium barbarum L.

圖4　臭氧處理時間對枸杞干果殺菌率的影響Fig.4　Influence of the ozone processing time on sterilization efficiency of dried Lycium barbarum L.

圖5　相對濕度對枸杞干果殺菌率的影響Fig.5　Influence of relative humidity on sterilization efficiency of dried Lycium barbarum L.

由單因素實驗結果分析可得，此實驗是臭氧紫外復合處理枸杞干果，輻射時間與臭氧處理時間最佳范圍大致相同，所以將這兩個因素合并為一個因素：處理時間，綜合考慮，確定出單因素實驗的最佳條件為：相對濕度90%±5%，輻射距離30cm，處理時間40min，臭氧濃度25.44mg/m3。

2.2響應面實驗結果及分析

2.2.1實驗設計與結果該研究選用Box-Behnken Design（BBD）實驗設計，整個實驗設計在三個中心點處共進行15次實驗，其中12次是分析實驗，實驗結果隨機完成，結果見表2。

通過Design Expert軟件對實驗數據進行回歸分析，得到響應值與各因素之間二次多元回歸擬合方程如下：

Y=99.88-0.35X1+0.062X2+2.27X3+0.095X1X2+ 0.28X1X3-0.69X12-0.68X22-1.53X32，對此模型進行方差分析，結果見表3。

由表3可知，該模型極顯著（p＜0.0001），表明本實驗采用的二次模型具有統計學意義；臭氧紫外殺菌率失擬項p=0.0711不顯著，表明該模型與實際實驗擬合程度較好，實驗誤差小，可以用來預測臭氧紫外復合作用對枸杞干果微生物殺菌工藝的條件。方程的一次項中X1、X3，二次項X12、X22、X32，交互項X1X3對響應值的影響極顯著（p＜0.01）。表明實驗的各因素與響應值之間關系復雜，不是簡單的線性關系。由F值的大小，可以反映出各實驗因素對響應值影響程度，F值越大，表明對響應值的影響越大。通過方差分析表可知，對枸杞干果微生物殺菌率影響程度的大小順序是：臭氧濃度＞輻射距離＞處理時間。

2.2.2響應面分析經Design Expert v8.0.6 Trial軟件分析，由回歸方程分析得到殺菌率與各因素的響應面結果見圖。3D響應面圖將二次回歸模型直觀的展現出來。在響應面圖中，曲面越陡峭，表明該實驗因素對響應值的影響越顯著。等高線圖與響應面圖相對應，等高線圖隨著響應面圖的變化而變化，其曲線越接近中心，則對應的響應值也就越大［13］。

表2　BBD實驗設計與結果Table 2　Design and result of BBD

表3　臭氧紫外復合殺菌率研究模型的方差分析結果Table 3　Research model analysis of variance for ozone and ultraviolet combined sterilization efficiency

圖6表示了處理時間和輻射距離對枸杞干果殺菌率的交互作用，隨著輻射距離的增大，殺菌率逐漸降低，當輻射距離大于30cm時，隨著處理時間的延長，殺菌率逐漸升高，說明距離遠時，處理時間影響比較顯著，而從整個交互作用來看，輻射距離對殺菌率影響比較大。

圖6　處理時間和輻射距離對枸杞干果殺菌率影響的響應面Fig.6　Response surface showing the effects of processing time and radiation distance on sterilization efficiency of dried Lycium barbarum L.

由圖7可以看出，無論處理時間短還是長，隨著臭氧濃度的增大，殺菌率都明顯增大。臭氧濃度一定時，隨著處理時間的增加，殺菌率呈緩慢的先增后減。

圖7　臭氧濃度和處理時間對枸杞干果殺菌率影響的響應面Fig.7　Response surface showing the effects of the ozone concentration and processing time on sterilization efficiency of dried Lycium barbarum L.

由圖8可以看出，響應面陡峭，臭氧濃度和輻射距離的交互作用對枸杞干果殺菌率的影響很顯著，當輻射距離小于40cm時，隨著臭氧濃度的增大，殺菌率都明顯增大，并能接近100%，但當輻射距離為40cm時，雖然殺菌率隨臭氧濃度的增大而增大，當殺菌率永遠都達不到100%；臭氧濃度一定時，隨著輻射距離的增大，殺菌率呈緩慢的先增后減。

圖8　臭氧濃度和輻射距離對枸杞干果殺菌率影響的響應面Fig.8　Response surface showing the effects of the ozone concentration and radiation distance on sterilization efficiency of dried Lycium barbarum L.

2.3最佳工藝參數的確定于模型驗證

在相對濕度為90%±5%，根據回歸方程預測及響應面分析結果，由軟件分析得出臭氧與紫外復合處理枸杞干果殺菌效果的最佳工藝條件為：輻射距離30.79cm、處理時間31.84min、臭氧濃度31.18mg/m3，理論殺菌率為100%。考慮到實際操作問題，最終確定臭氧與紫外復合處理枸杞干果殺菌效果的的最佳工藝條件為：輻射距離31cm、處理時間32min、臭氧濃度31mg/m3。以此條件進行3組平行驗證實驗，測得枸杞干果的殺菌率為99.999%，與理論值基本一致，說明方程與實際情況擬合較好，所建模型適用于研究臭氧與紫外復合處理對枸杞干果殺菌效果的影響。

2.4枸杞干果微生物降解前后品質變化測定

通過響應面優化出的最佳工藝條件：輻射距離31cm、處理時間32min、臭氧濃度31（mg/m3）以此條件進行3組平行實驗，測定臭氧與紫外復合處理前后的枸杞干果的品質指標，見表4。

表4　處理前后枸杞干果品質指標Table 4　The quality indexes of dried Lycium barbarum L.before and after processing

處理后灰分總糖、蛋白質、脂肪減少，水分的變化最大且處理后的水分增加，由于本實驗在相對濕度90%±5%的環境中進行的，枸杞容易吸潮，所以導致水分增加，但仍在枸杞干儲存范圍內，經方差分析可知處理前后各理化指標均無明顯差異，且微生物指標都在國家標準范圍內。

3　結論

本研究以臭氧與紫外復合處理枸杞干果，使用SPSS軟件和Design Expert軟件分析確定出臭氧與紫外復合處理枸杞干果殺菌效果的最佳工藝條件為：輻射距離31cm、處理時間32min、臭氧濃度31mg/m3，在此條件下實際測得臭氧紫外復合殺菌率為99.999%，菌落總數和大腸菌群數均在國家標準范圍之內；臭氧與紫外復合處理對枸杞干果品質無顯著影響，處理后的干果品質均在枸杞子進出口標準范圍之內，表明臭氧紫外復合作用在殺滅菌方面具有一定的優勢，為枸杞的安全性、可食性開辟了一條新的道路。

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Optimization of ozone and ultraviolet combined on dried Lycium barbarum L.sterilization process by response surface methodology

GONG Yuan1，LIU Dun-hua2，*，QU Yun-qing3，LIAO Ruo-yu3，XU Meng-xia3
（College of Agriculture，Ningxia University，Yinchuan 750021，China）

Ozone and ultraviolet combined on Lycium barbarum L.dry fruit sterilization process.Sterilization process conditions were further optimized using response surface methodology as follow：radiation distance 31cm，processing time 32min，the ozone concentration 31mg/m3，for this condition，the sterilizing efficiency of ozone and ultraviolet combined on Lycium barbarum L.could be 99.999%.The quality of Lycium barbarum L.dry fruit did not change significantly after treatment under optimum conditions（p＞0.05）.This result indicating that the compound effects of ozone and ultraviolet had a certain advantages in terms of sterilization and provided scientific data and effective technical means for microbes degradation of Lycium barbarum L.Ningxia.

Lycium barbarum L.；ozone and ultraviolet combined；sterilization efficiency

TS255.36

B

1002-0306（2015）12-0254-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.12.045

2014－10－30

龔媛（1989-），女，碩士研究生，研究方向：食品質量與安全。

劉敦華（1964-），男，博士，教授，研究方向：食品質量與安全。