恒溫超聲輔助提取訶子FRAP類抗氧化活性物質的研究

劉夢瑩，江慎華，2，3，*，曲文娟，2，金洪光，廖　亮，馬海樂，2，沈勇根，3，徐明生，3（.九江學院藥學與生命科學學院，江西九江332000；2.江蘇大學食品與生物工程學院，江蘇省農產品物理加工重點實驗室，江蘇鎮江2203；3.江西農業大學食品科學與工程學院，江西省天然產物與功能食品重點實驗室，江西南昌330045）

恒溫超聲輔助提取訶子FRAP類抗氧化活性物質的研究

劉夢瑩1，江慎華1，2，3，*，曲文娟1，2，金洪光1，廖亮1，馬海樂1，2，沈勇根1，3，徐明生1，3
（1.九江學院藥學與生命科學學院，江西九江332000；2.江蘇大學食品與生物工程學院，江蘇省農產品物理加工重點實驗室，江蘇鎮江212013；3.江西農業大學食品科學與工程學院，江西省天然產物與功能食品重點實驗室，江西南昌330045）

為了探索恒溫超聲輔助提取訶子FRAP類抗氧化活性物質提取效果，本文采用該技術首先對提取工藝進行優化，進而通過比較實驗和掃描電鏡分析該技術提取高效的原因。結果表明，訶子FRAP類抗氧化活性物質恒溫超聲輔助提取最佳工藝條件為：采用60%乙醇、超聲功率180 W、超聲頻率80 kHz、超聲溫度70℃；比較分析發現，該工藝提取效率顯著高于水浴振蕩提取工藝（p＜0.001）；掃描電鏡分析發現，恒溫超聲輔助提取對訶子原料細胞結構破壞更嚴重，從而增強了提取效率。恒溫超聲輔助提取技術對訶子抗氧化活性物質提取效率高，本文可為訶子產業化開發提供依據。

恒溫超聲輔助提取，訶子，抗氧化活性物質，掃描電鏡

超聲波技術被廣泛應用于天然產物中生物活性物質提取［1］。其作用原理主要是空化效應、機械效應和熱效應，能加速細胞壁破碎、增加穿透性與傳質效應，具有提取時間短、能耗低、提取率高等優點［1］。其中，頻率和強度是影響超聲提取效率的主要參數［2］。因超聲提取中存在熱效應，傳統超聲提取過程中溶液的溫度無法穩定，常處于緩慢上升過程，從而影響提取效果［3］。

尋找安全高效的天然抗氧化劑成為食品原料領域的一個研究熱點［4］。訶子為使君子科欖仁樹屬木本科植物訶子（Terminalia chebula Retz）成熟的干燥果實，被譽為“藏藥之王”，具有抗氧化、抑制低密度脂蛋白氧化修飾等多種藥理功效［5-6］。前人對其抗氧化功能及采用超聲輔助技術對訶子抗氧化活性物質提取工藝進行了研究［7-8］。但是，超聲頻率對訶子抗氧化活性物質提取效率的影響未見報道。同時，傳統超聲波設備提取過程中溫度無法穩定，會逐漸上升，無法真實反應超聲提取效果。

本實驗室前期研究發現，訶子在衛生部公布的114種可用于保健食品原料中抗氧化活性高居第一［9-11］。因此，本實驗在此基礎上采用三頻恒溫數控超聲波提取設備，通過儀器自身的控溫功能，同時改變頻率，對訶子抗氧化活性物質提取工藝進行優化并驗證，并將該工藝與水浴振蕩提取工藝進行比較，且采用掃描電鏡對提取前后的原料進行比較以分析高效原因，以期為開發訶子抗氧化功能食品提供參考。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

訶子生產批號：20120701，生產日期：2012年7月5號，產地廣西，購自湖南松齡堂中藥飲片有限公司，藥材買回后計算需求量后粉碎、過60目篩置冰箱中供實驗周期內備用；其余化學試劑均為國產分析純。

KQ-300GVDV型三頻恒溫數控超聲波清洗器昆山市超聲儀器有限公司；UNIC 7200型可見分光光度計尤尼柯（上海）儀器有限公司；VEGA（Ⅱ）LSU型掃描電子顯微鏡捷克（TESCAN）泰思肯公司；SHA-B恒溫振蕩器常州國華電器有限公司；DL-5C型離心機上海安亭科學儀器廠；101-1AB型電熱鼓風干燥箱天津市泰斯特儀器有公司；DFY-300搖擺式高速萬能粉碎機溫嶺市林大機械有限公司；XW-80A漩渦混合器上海青浦滬西儀器廠。

1.2實驗方法

1.2.1恒溫超聲輔助提取FRAP類抗氧化物質稱取5.000 g訶子粉末于150 mL具塞錐形瓶中進行恒溫超聲提取，每次提取后離心，共提取3次，上清液合并、定容成統一體積，稀釋400倍后測定FRAP值評價提取率。其中，料液比是指訶子粉質量（g）與提取溶劑體積（mL）的比例。

1.2.2單因素實驗設計

1.2.2.1超聲時間單因素實驗固定提取條件：1∶20料液比、60%乙醇、超聲功率240 W、超聲頻率45 kHz、超聲溫度60℃。選定超聲時間3、5、7、9、11、13、15 min做時間單因素實驗。

1.2.2.2超聲頻率單因素實驗固定提取條件：1∶20料液比、60%乙醇、超聲功率240 W、超聲時間9 min、超聲溫度60℃。選取超聲頻率45、80、100 kHz做超聲頻率單因素實驗。

1.2.2.3超聲功率單因素實驗固定提取條件：1∶20料液比、60%乙醇、超聲頻率45 kHz、超聲時間9 min、超聲溫度60℃。選取超聲功率120、150、180、210、240、270、300 W做超聲功率單因素實驗。

1.2.2.4超聲溫度單因素實驗固定提取條件：1∶20料液比、60%乙醇、超聲功率210 W、超聲時間9 min、超聲頻率45 kHz。選取溫度40、45、50、55、60、65、70、75、80做超聲溫度單因素實驗。

1.2.2.5乙醇濃度單因素實驗固定提取條件：1∶20料液比、超聲功率210 W、超聲時間9 min、超聲頻率45 kHz、超聲溫度70℃。選取乙醇濃度30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%做乙醇濃度單因素實驗。

1.2.2.6料液比單因素實驗固定提取條件：60%乙醇、超聲功率210 W、超聲時間9 min、超聲頻率45 kHz、超聲溫度70℃。選取料液比1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40做料液比單因素實驗。

1.2.3正交實驗在單因素實驗的基礎上，設計4因素3水平［L9（34）］正交實驗，其因素水平如表1所示，以FRAP值衡量提取效率。

表1　恒溫超聲輔助提取訶子抗氧化活性物質正交實驗Table 1　The orthogonal experiments of UAECTT for extacting antioxidants from TCR

1.2.4驗證實驗選取恒溫超聲輔助提取最佳工藝與正交實驗中FRAP值最高實驗組進行比較和驗證，由此證明該最優提取工藝的可靠性。

1.2.5恒溫超聲優化工藝與水浴振蕩優化工藝提取效率的比較為了衡量恒溫超聲提取效率，將該工藝與實驗室前期確定的水浴振蕩最佳提取工藝進行了比較。

1.2.5.1超聲優化提取實驗提取條件：1∶20料液比、超聲功率210 W、超聲時間9 min、超聲頻率80 kHz、超聲溫度70℃、乙醇濃度60%、提取次數3次。

1.2.5.2水浴振蕩提取實驗提取條件：1∶20料液比、水浴時間7 min、水浴溫度70℃、乙醇濃度50%、提取次數4次。

1.2.6指標的測定

1.2.6.1總多酚含量的測定采用江慎華等［12］方法測定總多酚含量。取稀釋10倍后的Folin試劑稀釋液2.25 mL加入到0.5 mL樣液中，然后加入2.25 mL 6%的無水碳酸鈉溶液，振蕩均勻、35℃水浴中靜置90 min后于波長765 nm處讀數。將沒食子酸配成質量濃度為0、3.125、6.25、12.5、25、50、100、150 μg/mL 8個樣液制作標準曲線，得回歸方程：y=0.0134x+0.0332（r=0.9981）。

1.2.6.2FRAP法抗氧化活性的測定用江慎華等［12］方法，略作改進，具體步驟如下。

取100 μL樣液同1.0 mL FRAP工作液混合均勻，37℃反應40 min后，于波長593 nm測定吸光度，吸光度越高抗氧化能力越強。FRAP工作液由0.3 mol/L pH3.6的乙酸鈉緩沖液（3.1 g三水乙酸鈉和16 mL冰乙酸溶于1000 mL蒸餾水中即得）、10 mmol/L TPTZ溶液（TPTZ溶液采用40 mmol/L優級純HCl溶解）和20 mmol/L三氯化鐵以體積比10∶1∶1混勻，現用現配。將FeSO4·7H2O配成濃度為0、100、200、400、600、1000 μmol/L的樣液制作標準曲線，得曲線方程y= 0.0017x+0.0972（r=0.9946），FRAP值計算公式如下：

式中：W—FRAP值，訶子抗氧化活性物質提取率，μmol/g；C—FRAP摩爾濃度，每升提取液中所含抗氧化活性物質微摩爾數，μmol/L；U—稀釋倍數；V—定容體積，L；m—原料質量，訶子粉末質量，g。

1.2.7掃描電鏡微觀結構分析將恒溫超聲提取和水浴振蕩提取后的樣品粉末60℃烘干后過60目篩。篩選后取少量訶子粉末在離子濺射儀中完成真空噴鍍后進行掃描電子顯微鏡分析。

1.2.8數據處理實驗均三次重復，結果以平均值±標準偏差表示。采用Excel和DPS軟件對實驗數據進行整理及統計分析。

2　結果與分析

2.1訶子抗氧化活性物質提取單因素實驗

2.1.1超聲時間單因素實驗時間單因素實驗結果如圖1所示。由圖1可以看出，恒溫超聲提取3～9 min范圍內，訶子提取液FRAP值隨著超聲時間的延長而升高，當超聲時間達到9 min時含量達到最大值，此后隨著超聲時間的延長該值逐漸減少。在3～9 min時間段，由于超聲空化效應，加速了植物原料的溶脹和水合作用，從而提高有效成分得率［15］。恒溫超聲提取9 min后提取率降低可能是因為加熱時間延長而致提取出的一些熱敏性成分轉化降解［3］。盡管9 min提取率最高，但是，統計分析發現其與相鄰的7 min和 11 min的提取效率并沒有顯著性差異（p＞0.05）；同時，因原料本身經過泡制等處理，導致在很短時間（9 min）內提取率即能達到最高。因此，固定提取時間為9 min做正交實驗。

圖1　超聲輔助提取時間單因素實驗Fig.1　Results of extraction time experiment by UAECTT

2.1.2超聲頻率單因素實驗根據三頻恒溫數控超聲波清洗器固有的三種頻率設置超聲頻率對訶子抗氧化活性物質提取的影響結果如圖2所示。由圖2可知，隨著超聲頻率增大，提取液FRAP值逐漸降低。超聲波頻率與波長成反比，隨著頻率增加，其波長隨之減低，造成聲波在傳播過程中衰減加快，進而影響到對細胞的破碎效率［17］；而且頻率與振幅也成反比，頻率低則振幅高，使單次的空化和剪切力等作用增強［18］。基于以上原因，造成提取液FRAP值含量隨頻率升高而下降。吳熙［19］和胡殿麗等［20］在研究超聲提取木蝴蝶總黃酮和黃柏小檗堿時也得到了相似結果。本實驗選定超聲頻率45、80、100 kHz做正交實驗。

圖2　超聲輔助提取頻率單因素實驗Fig.2　Results of ultrasonic frequency experiment by UAECTT

2.1.3超聲功率單因素實驗功率單因素對實驗的影響結果見圖3。可以看出，在超聲功率120～210 W范圍內，提取液FRAP值隨著超聲功率的增大逐漸增大；當提取功率大于210 W以后，提取液FRAP值隨著時間的增加反而逐漸降低。超聲波通過液體介質時，大量的氣泡會產生、破裂，導致強烈聲沖流的形成；超聲產生的烈震波和高速噴射使得原料分子溶脹，進而使有效成分加速進入提取溶劑［16］，一定超聲功率范圍，促進訶子抗氧化活性物質溶出。當功率過高時，造成溫度過高會促使某些多酚類抗氧化活性物質的分解［3］。同時，隨功率增加，雜質溶出增加，使訶子抗氧化活性物質的提取率降低［3］。本實驗選定提取功率180、210和240 W做正交實驗。

圖3　超聲輔助提取功率單因素實驗Fig.3　Results of ultrasonic power experiment by UAECTT

2.1.4超聲溫度單因素實驗溫度單因素實驗結果見圖4。在40～70℃溫度范圍內，提取液FRAP值隨超聲溫度升高而逐漸上升，70℃達最高，當超過70℃后反而下降。其原因可能是，在低溫時，超聲波未能將細胞徹底破碎，有效成分溶解度較低；隨著溫度升高，分子熱運動加速，進一步破碎細胞結構，溶液擴散進入細胞速度加快［21］，從而提高訶子抗氧化活性物質的提取率。但是，隨溫度增加接近至溶劑沸點時，會因為溶劑汽化而減少固液間的有效接觸面積，提取速率反而下降。此外，高溫容易使熱不穩定的抗氧化活性物質降解［22］。選定65、70、75℃做正交實驗。

圖4　超聲輔助提取溫度單因素實驗Fig.4　Results of ultrasonic temperature experiment by UAECTT

2.1.5乙醇濃度單因素實驗乙醇濃度對訶子抗氧化活性物質提取的影響結果如圖5所示。從圖5可以看出，在30%～60%的濃度范圍內，提取液FRAP值隨著乙醇濃度的增大而快速上升，60%時達最大，在70%～90%范圍內反而下降較快。植物體內的多酚部分與蛋白質等通過氫鍵或疏水鍵結合的形式存在于細胞壁中。當乙醇濃度過高時，會使蛋白質變性，使與之結合的抗氧化活性物質的溶出減少［13］；同時可能因溶劑揮發增大，醇溶性雜質溶出增加，而干擾與之結合的抗氧化活性物質的溶出［14］。因此選定50%、60%和70%乙醇做正交實驗。

圖5　超聲輔助提取乙醇濃度單因素實驗Fig.5　Results of ethanol concentration experiment by UAECTT

2.1.6料液比單因素實驗料液比對訶子抗氧化活性物質提取的影響結果如圖6所示。隨著提取料液比增大，提取液FRAP值逐漸增加，當料液比達到1∶20后，提取液FRAP值變化不大。超聲波傳遞產生的聲空化使溶劑空洞即空化氣泡形成，在液體介質中其可通過改變自身大小來釋放大量能量，空化氣泡破裂時的能量不僅使細胞壁孔增大，而且促使細胞壁破裂，提高有效成分質量傳遞，進而提高得率。但隨著料液比的增大，空穴作用強度降低，當超過一定范圍時，介質的自然凝聚力增強，少部分區域形成負壓，從而抑制空化作用［15］。因此，綜合考慮生產成本和后續處理，正交實驗選定料液比1∶20為固定參數。

圖6　超聲輔助提取料液比單因素實驗Fig.6　Results of solvent to solid ratio experiment by UAECTT

2.2恒溫超聲輔助提取訶子FRAP抗氧化活性物質正交實驗

根據上述單因素實驗結果確定的四因素三水平正交實驗結果如表2所示。由表2可以看出，影響超聲輔助提取訶子抗氧化活性物質的因素從大到小排序依次為：乙醇濃度＞超聲頻率＞超聲溫度＞超聲功率，最佳提取工藝為：A2B2C1D2，即提取乙醇濃度60%、超聲頻率80 kHz、超聲功率180 W、超聲溫度70℃。由方差分析表3可見，乙醇濃度、超聲頻率和超聲功率三個因素對提取結果均產生極顯著性影響（p＜0.01）。

2.3驗證實驗

選取超聲輔助提取優化工藝（A2B2C1D2）與正交實驗中FRAP值最高組（A2B2C3D1）進行驗證實驗。按照正交最佳工藝所得提取液FRAP值［（5429.65± 21.18）μmol/g］極顯著性高于正交表中FRAP值最高組［（5274.35±37.35）μmol/g］（p＜0.001）。由此證明該最優提取工藝較為可靠，可以考慮作為后續擴大提取工藝的提取條件。

2.4恒溫超聲輔助與水浴振蕩提取效率的比較

水浴振蕩提取液FRAP值和總多酚含量分別（4987.29±47）μmol/g及（0.294±0.0063）g/g，恒溫超聲提取液FRAP值和總多酚含量分別達（5401.41± 28.23）μmol/g及（0.313±0.0045）g/g。前者提取液FRAP值和總多酚含量分別僅為后者的92.33%及93.93%，具有極顯著性差異（p＜0.001）。比較結果說明恒溫超聲輔助法提取效率優于傳統水浴振蕩提取方法。Cheung Y［23］和Chen等［24］從藥用真菌和纖孔菌屬中提取多糖時比較了超聲輔助提取法和水浴振蕩法，也得出與本實驗相似的結論。

2.5采用掃描電鏡對樣品微觀結構分析

未經過提取處理的訶子粉末其組織表面光滑，結構致密完整，但經過超聲優化提取9 min與水浴振蕩提取7 min后，其組織和細胞內部結構變得松散，并均遭受到不同程度的破壞（圖7）。相比較而言，水浴振蕩提取7 min后，訶子的細胞內部結構更為致密、光滑；而經過超聲提取后，粉末內部的組織成分無法識別，細胞微觀結構遭到更嚴重的破壞。其主要的原因可能是超聲提取產生的機械粉碎等作用使訶子細胞壁破裂，改變其內部結構，產生空化效應并增加了傳質速率，進而使有效成分提取率增加［25-26］。在空穴作用中，液體介質產生氣泡，并隨聲波增強而增多，空穴作用導致溫度和壓強大幅度升高，使泡沫崩解，產生猛烈的沖擊波，加強溶劑系統內的傳質過程。隨后，超聲波擴散通過細胞壁并使其破碎，細胞內容物迅速溶出［27］。Balachandranl［28］研究超聲提取和水浴振蕩提取姜中刺激性化合物組分時，也從電鏡圖像中觀察到與本文相類似的結果。

表2　恒溫超聲輔助提取訶子抗氧化活性物質正交實驗Table 2　Orthogonal experiments for extracting antioxidants from TCR by UAECTT

表3　恒溫超聲輔助提取訶子總多酚正交實驗方差分析Table 3　Analysis of orthogonal experiments

圖7　訶子粉末恒溫超聲、水浴振蕩提取前后掃描電鏡微觀結構比較（2500×）Fig.7　The microcosmic comparasion of TCR powders by scanning electron microscope among native powders，UAECTT powders and WBOE powders（2500×）

3　結論

3.1通過單因素和正交實驗，以FRAP值為評價指標確定了恒溫超聲輔助提取訶子抗氧化活性物質的最佳工藝為：乙醇濃度60%、超聲頻率80 kHz、超聲功率180 W、超聲溫度70℃，在此條件下提取液FRAP值可達（5429.65±21.18）μmol/g。

3.2比較實驗發現，恒溫超聲輔助最佳工藝提取效率顯著性高于水浴振蕩最佳工藝（p＜0.001），可考慮用于后續對訶子抗氧化活性物質提取。

3.3掃描電鏡結果表明，與水浴振蕩提取相比，恒溫超聲提取對原料粉末產生更強的破壞作用，并使其組織和細胞的微觀結構比提取前破壞更嚴重，增加溶劑向胞內浸透速率，使得訶子內抗氧化活性物質迅速、充分溶出，提取效率顯著提高。

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The FRAP antioxidants extraction from Terminalia chebula Retz based on ultrasound assisted extraction with constant temperature

LIU Meng-ying1，JIANG Shen-hua1，2，3，*，QU Wen-juan1，2，JIN Hong-guang1，LIAO Liang1，MA Hai-le1，2，SHEN Yong-gen1，3，XU Ming-sheng1，3
（1.School of Pharmacy and Life Science，Jiujiang University，Jiujiang 332000，China；2.School of Food and Biological Engineering，Jiangsu Provincal Key Lab of Physical Processing of Agricultural Products，Jiangsu University，Zhenjiang 212013，China；3.College of Food Science and Engineering，Jiangxi Key Laboratory of Natural Products and Functional Foods，Jiangxi Agricultural University，Nanchang 330045，China）

In order to explore the extracting effect of antioxidants from Terminalia chebula Retz（TCR）based on ultrasound assisted extraction with constant temperature technology（UAECTT），at first，the extraction technology of antioxidants were optimized，then the reasons for high efficiency of this extraction technology were analysized by comparative experiments and scanning electron microscope（SEM）.The optimal parameters of the extracting technology were as follows the concentration of ethanol 60%，the ultrasound frequency 80 kHz，the ultrasound power 180 W，and the extracting temperature 70℃.The extraction efficiency of UAECTT dramaticlly was higher than that of water bath oscillator extraction（WBOE）（p＜0.001）based on the comparative analysis.A comparison of SEM images of TCR powders indicated the extraction efficiency was higher treated by UAECTT with the more serious disruption of cell structure and the more sufficient interaction.The technology of UAECTT was proved as one technology with high efficiency for extracting TCR antioxidants and this study provided the basis for future industrializing development of TCR.

ultrasound assisted extraction with constant temperature；Terminalia chebula Retz；antioxidants；scanning electron microscope

TS201.2

B

1002-0306（2015）20-0238-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.20.042

2015－03－09

劉夢瑩（1993-），女，大學本科，主要從事天然產物研究與開發方面的工作，E-mail：1048188096@qq.com。

江慎華（1973-），男，博士，副教授，主要從事天然產物研究與開發方面的工作，E-mail：jiangshenhua66@163.com。

江蘇省青年自然科學基金（BK2012287）；國家自然科學基金（31360371）；江西省自然科學基金（20132BAB204030）；江西省科技支撐計劃（20123BBF60150）；江蘇省農產品物理加工重點實驗室開放課題（JAPP2010-5）；江西省高等學校大學生創新創業計劃項目；江西省天然產物與功能食品重點實驗室開放基金；九江市科技支撐計劃（201438）。