牛磺酸對丙烯酰胺致SH-SY5Y細胞損傷的保護作用

郝瑞芳，景　浩（.山西林業職業技術學院園藝系，山西太原030009；2.中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京00083）

牛磺酸對丙烯酰胺致SH-SY5Y細胞損傷的保護作用

郝瑞芳1，景浩2，*
（1.山西林業職業技術學院園藝系，山西太原030009；2.中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京100083）

用丙烯酰胺誘導SH-SY5Y神經細胞損傷建立細胞損傷模型，研究牛磺酸對SH-SY5Y細胞的保護作用。MTT法和LDH法測定結果顯示：用100～700 μg/mL丙烯酰胺對SH-SY5Y細胞孵育8 h，細胞存活率下降至52%～81%，表明丙烯酰胺對SH-SY5Y細胞有一定的損傷作用，導致細胞膜受損，LDH釋放到細胞膜外。經牛磺酸（50、100、200 μg/mL）預先孵育1 h后，再用300 μg/mL丙烯酰胺對細胞孵育8 h，SH-SY5Y細胞的存活率分別升高至81.6%、92.7%、89.7%，顯著高于丙烯酰胺損傷組的細胞存活率（67.6%）；且LDH釋放程度呈現出下降趨勢，LDH釋放率分別為：150.7%、138.8%、113.3%，和丙烯酰胺損傷組的LDH釋放率（188.5%）相比均顯著降低。該研究結果表明牛磺酸對丙烯酰胺誘導的SHSY5Y細胞損傷具有保護作用。

牛磺酸，丙烯酰胺，SH-SY5Y細胞，損傷

丙烯酰胺（Acrylamide）對大鼠肝細胞、鼠腎上皮細胞、人角質形成細胞、神經膠質細胞均具有毒性作用，可引起細胞發生氧化應激損傷［1-4］。丙烯酰胺能降低SH-SY5Y細胞的活力，增加乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）的釋放量，促進細胞的凋亡。LDH是細胞能量代謝中的一個重要的酶，細胞釋放LDH增加，通常反映細胞受損傷，細胞膜通透性增加。

牛磺酸（Taurine）主要存在于心肌細胞，對肝細胞、心肌細胞、紅細胞等都具有保護作用。牛磺酸能夠維持細胞內外滲透壓平衡，調節細胞鈣穩態。牛磺酸可能通過激活膜表面鈣泵使細胞漿內Ca2+泵出細胞或進入細胞內的鈣庫，從而抑制細胞內鈣超載［5］。牛磺酸還具有抗氧化作用，能清除氧自由基，抑制細胞膜的過氧化損傷，保護膜的穩定性。牛磺酸參與細胞膜的主要成分磷脂的代謝，保護細胞膜磷脂免受降解，調節膜對離子的通透性并呈劑量依賴地抑制溶酶體內組織蛋白酶的漏出。牛磺酸還能抑制四氯化碳引發的脂質過氧化作用，減少丙二醛的生成、丙氨酸轉氨酶和天冬氨酸轉氨酶的釋放，有效保護肝細胞［6］。

SH-SY5Y神經細胞株來源于人類胚胎中腦，是一種分化程度較低的神經母細胞瘤。其細胞形態和生理功能與正常神經元相似，被廣泛用于神經損傷的分子機制研究。本實驗選用SH-SY5Y細胞，用丙烯酰胺誘導細胞損傷，建立細胞損傷模型，探討牛磺酸對丙烯酰胺致SH-SY5Y細胞的損傷是否具有保護作用。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

人神經母細胞瘤SH-SY5Y購自中國協和醫科大學；高糖型DMEM培養液美國Invitrogen公司；胎牛血清（Fetal bovine serum，FBS）北京鼎國生物技術有限責任公司；胰蛋白酶、噻唑藍（MTT）、丙酮酸鈉、還原型NADH美國Sigma公司；丙烯酰胺標準品，純度99.5%德國Labor Dr.Ehrenstorfer-Schafers公司；牛磺酸國藥集團化學試劑有限公司；其他藥品均為國產分析純。

MCO-15AC型二氧化碳培養箱日本SANYO（三洋）公司；XDL-2型倒置生物顯微鏡重慶光電儀器有限公司；BSC-1500ⅡA2-X型生物安全柜濟南市鑫貝西生物技術有限公司；680型酶標儀美國Bio-Rad公司；FA1004型電子天平上海越平科學儀器有限公司；UNICO 2800型紫外分光光度計上海滬粵明科學儀器有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1試液配制

1.2.1.1丙烯酰胺（99.5%）儲備液配制濃度為1.0 mg/mL的丙烯酰胺溶液，作為儲備液。

1.2.1.2磷酸鹽（PBS）緩沖液配制稱取KH2PO40.20 g，Na2HPO4·12H2O 2.90 g，KCl 0.20 g，NaCl 8.00 g，加900 mL去離子水溶解，用18%的HCl調pH至7.4，最后定容至1 L。

1.2.1.3牛磺酸溶液和丙烯酰胺溶液用PBS緩沖液溶解牛磺酸和丙烯酰胺，分別配制成5 mg/mL的儲備液，在生物安全柜內用0.22 μm濾膜過濾除菌，備用。臨用前分別用不含血清的DMEM培養液稀釋到所需濃度。

1.2.2細胞培養將SH-SY5Y細胞培養于含20%胎牛血清的高糖DMEM培養液，置于CO2培養箱（37℃，5%CO2）培養。當細胞生長至80%～90%融合時，進行傳代。每3～4 d傳代一次。取對數生長期細胞分組進行實驗。

1.2.3牛磺酸對細胞生長的影響將對數生長期的細胞消化，制備成均勻的細胞懸液。取96孔細胞培養板，每孔加100 μL細胞懸液，細胞密度為5×105個/mL。培養48 h后棄培養液，每孔加入100 μL含不同濃度（50、100、200、400 μg/mL）的牛磺酸溶液，37℃孵育8 h；棄去牛磺酸溶液，每孔加入100 μL培養液繼續培養48 h，在倒置顯微鏡下觀察細胞形態，并用MTT法檢測細胞活性。

MTT法步驟如下：不同濃度的牛磺酸處理組均設3個重復孔，以不加細胞懸液和牛磺酸的組為空白組，以加PBS處理的正常細胞組為對照組；各組細胞培養結束時，棄去各孔中的培養液，加入100 μL不含血清的DMEM-MTT溶液（MTT終濃度0.5 mg/mL），在細胞培養箱內繼續孵育4 h；加入100 μL鹽酸-異丙醇溶液（含0.04 moL/L HCl）/孔，振蕩至藍紫色結晶完全溶解；用酶標儀于570 nm處測定各孔的吸光值（Abs570），以吸光值反映細胞的生長抑制。

1.2.4細胞損傷模型的建立SH-SY5Y細胞接種于96孔板培養48 h后棄培養液，每孔加入100 μL含不同濃度的丙烯酰胺溶液（終濃度100～700 μg/mL），37℃孵育2～12 h；棄去丙烯酰胺溶液，每孔加入100 μL培養液繼續培養24 h，用MTT法測定細胞存活率，確定細胞損傷模型的丙烯酰胺濃度［7］。

1.2.5牛磺酸對丙烯酰胺致細胞損傷的保護作用

1.2.5.1細胞處理根據上述實驗結果確定牛磺酸和丙烯酰胺的劑量。實驗設計對照組（正常細胞組）、牛磺酸-200組、丙烯酰胺損傷組、實驗組（高、中、低濃度的牛磺酸+丙烯酰胺）。SH-SY5Y細胞接種于96孔板培養48 h后棄去培養液，然后給予牛磺酸和丙烯酰胺處理。具體步驟如下：實驗組每孔先加入50 μL牛磺酸溶液（終濃度為50、100、200 μg/mL），對照組、牛磺酸-200組和損傷組給予等體積的不含血清的DMEM培養液，37℃預孵育1 h后，對照組再加入50 μL不含血清的DMEM培養液，牛磺酸-200組再加入50 μL牛磺酸溶液（終濃度200 μg/mL）；其余組均加入50 μL丙烯酰胺（終濃度300 μg/mL），進行損傷處理（細胞于37℃繼續孵育8 h）。損傷處理結束后，所有組均棄去各孔中的樣品溶液，加100 μL細胞培養液繼續培養24 h。用倒置顯微鏡觀察細胞形態，并進行細胞存活率和LDH釋放率的測定。

1.2.5.2細胞形態的觀察接種于96孔培養板的細胞經牛磺酸和丙烯酰胺處理結束后，在倒置顯微鏡下觀察并拍照，物鏡放大倍數為10倍，目鏡放大倍數為10倍，總放大倍數為100倍。

1.2.5.3LDH釋放量的測定將SH-SY5Y細胞接種于24孔細胞培養板培養24 h后棄培養液，每孔先加入500 μL牛磺酸（終濃度50、100、200 μg/mL）預孵育1 h，再加入500 μL丙烯酰胺（終濃度300 μg/mL）進行損傷處理8 h。損傷處理結束后收集各孔內溶液至1.5 mL離心管中，500 r/min離心10 min。取100 μL離心后的上清液，加2 mL Tris-EDTA-NADH溶液，混合，37℃孵育10 min，再加入200 μL預熱（37℃）過的丙酮酸鈉溶液，快速混勻（限制在3 s內），用紫外分光光度計在340 nm處測定吸光值，并記錄3 min反應時吸光值的下降數值，LDH釋放率用實驗組的吸光值下降數值與對照組的吸光值下降數值的比值表示［8］。

1.2.6統計分析每個實驗重復三次，每個重復測定三次，結果表示為Means±SD。采用MINITAB 13.20軟件進行One-way ANOVA分析。鄧肯氏多重檢驗用來確定數據間的差異，顯著水平為p＜0.05。

2　結果與分析

2.1牛磺酸對SH-SY5Y細胞生長的影響

從表1可以看出，用50～200 μg/mL的牛磺酸對SH-SY5Y細胞孵育4 h，牛磺酸不僅對細胞生長無抑制作用，還顯著促進了細胞的生長；當濃度達到400 μg/mL時，牛磺酸對細胞生長有顯著抑制作用，細胞存活率低于90%。孵育6～8 h，牛磺酸為50～200 μg/mL時，對SH-SY5Y細胞的生長無促進也無抑制作用，濃度為400 μg/mL時會顯著抑制細胞的生長，存活率下降至84.2%。最終確定用濃度為50、100、200 μg/mL的牛磺酸來探討對丙烯酰胺致SH-SY5Y細胞損傷的保護作用。

表1　牛磺酸對SH-SY5Y細胞生長的影響Table 1　Effect of taurine on cell growth of SH-SY5Y

2.2丙烯酰胺對SH-SY5Y細胞生長的抑制

從圖1可以看出，丙烯酰胺濃度介于100～400 μg/mL時，孵育4～6 h，對SH-SY5Y細胞的生長影響較小，細胞存活率為90%以上，和對照組相比無顯著差異；隨著丙烯酰胺濃度繼續升高，細胞存活率顯著降低，最低為70%；孵育8 h時，丙烯酰胺濃度為100 μg/mL即顯著抑制SH-SY5Y細胞的生長，細胞存活率降至81%；丙烯酰胺為300 μg/mL時，細胞的存活率為70%；當丙烯酰胺為700 μg/mL時，細胞的存活率僅為52%，該結果與文獻的研究結果基本一致［9-10］。因此，選用濃度為300 μg/mL的丙烯酰胺對SH-SY5Y細胞孵育8 h建立細胞損傷模型。Okuno等［9］研究表明丙烯酰胺對SH-SY5Y細胞具有毒性作用，細胞的存活率與丙烯酰胺的濃度和孵育時間呈依賴性。用0.5～5 mmoL/L的丙烯酰胺對SH-SY5Y細胞孵育20 h，細胞存活率最低70%；用5 mmoL/L的丙烯酰胺孵育0～24 h，細胞存活率也隨時間的延長逐漸下降，最低約70%。用1～5 mmoL/L的丙烯酰胺對SHSY5Y細胞孵育20 h，結果表明細胞存活率隨丙烯酰胺濃度的增加而逐漸下降，最低至約30%［10］。

圖1　丙烯酰胺對SH-SY5Y細胞生長的抑制作用Fig.1　Inhibitory effect of acrylamide on cell growth of SH-SY5Y

2.3牛磺酸對丙烯酰胺致SH-SY5Y細胞損傷的保護作用

2.3.1細胞形態學變化如圖2所示，正常對照組的SH-SY5Y細胞生長良好，形態正常，呈錐體狀并有明顯的軸突，胞體均勻分布，輪廓清晰、胞漿均勻。單獨加牛磺酸（200 μg/mL）孵育8 h，SH-SY5Y細胞同樣生長良好，胞體均勻分布，與對照組無差別。單獨加丙烯酰胺孵育8 h，活細胞數量明顯減少，貼壁細胞變稀疏，細胞胞體皺縮、脫落、死亡；存活的細胞體積明顯變小，細胞長得不飽滿，胞質回縮，大小不一致。經不同濃度的牛磺酸保護后，細胞損傷程度明顯減輕，和丙烯酰胺損傷組相比，細胞形態有明顯改善，活細胞數量明顯增多，且牛磺酸的濃度越高，對細胞的保護作用越大，中、高劑量保護組之間活細胞數量差異不明顯（圖2）。

圖2　牛磺酸對丙烯酰胺致SH-SY5Y細胞形態改變的保護作用Fig.2　Protective effect of taurine on morphological change induced by acrylamide in SH-SY5Y cell

2.3.2細胞存活率和LDH釋放率本實驗以MTT法檢測細胞存活率，對照組對SH-SY5Y細胞孵育8 h，細胞生長良好，存活率為99.4%；單獨加入丙烯酰胺作用8 h，SH-SY5Y細胞的生長明顯受到抑制，細胞存活率僅為67.6%；經不同濃度的牛磺酸保護后，牛磺酸為50、100和200 μg/mL時，SH-SY5Y細胞的存活率分別為81.6%、92.7%、89.7%，細胞存活率顯著增強。高、中劑量的牛磺酸對細胞的保護作用顯著高于低劑量組（表2）。

表2還顯示了不同組中LDH的釋放量情況。與對照組相比，丙烯酰胺單獨作用SH-SY5Y細胞8 h后，細胞LDH的釋放率顯著升高，達到188.5%，說明丙烯酰胺對SH-SY5Y細胞具有毒性作用，細胞膜受損，導致LDH釋放到膜外的量增加。經不同濃度的牛磺酸保護后，LDH釋放程度呈現出下降趨勢，和丙烯酰胺損傷組相比均有顯著降低，且添加物濃度越高，對細胞的保護作用越強。和正常對照組比較，高、中、低濃度的牛磺酸保護組中LDH釋放率分別為：113.3%、138.8%、150.7%，高劑量組對細胞的保護作用明顯高于中、低劑量組。

MTT和LDH的結果顯示，牛磺酸對丙烯酰胺導致的SH-SY5Y細胞損傷具有顯著的保護作用，保護作用與牛磺酸的添加濃度有關。

表2　牛磺酸對丙烯酰胺致SH-SY5Y細胞損傷的保護作用Table 2　Protective effect of taurine on acrylamide-induced cytotoxicity in SH-SY5Y cell

3　討論

已有大量文獻報道丙烯酰胺具有一定的細胞毒性作用。用10～100 μmol/L的丙烯酰胺對小鼠腎上皮細胞孵育7 d，丙烯酰胺可明顯抑制細胞分化，表現為細胞集落數目減少，出現細胞脫落、漂浮、細胞碎片等現象，蛋白質含量下降，說明該濃度范圍的丙烯酰胺對新生小鼠腎上皮細胞有明顯的毒作用［4］。Sumizawa等［10-11］研究表明丙烯酰胺（1～3 mmoL/L）能降低SH-SY5Y細胞的存活率，增加LDH的釋放量；丙烯酰胺還誘導SH-SY5Y細胞在sub G1周期中的數量顯著增加，激活細胞內的caspase-3活性，從而導致細胞凋亡。

牛磺酸具有抗氧化作用，能清除氧自由基，抑制細胞膜的過氧化損傷。胡錦東等［12］研究發現牛磺酸可拮抗鉛引起的大鼠肝脂質過氧化損傷，使染鉛大鼠體內的丙二醛含量下降，并明顯恢復超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶的活力，使其恢復到正常對照組水平，體現了牛磺酸的保護作用。莊園等［13］研究了牛磺酸對高溫處理后神經上皮細胞存活和分化的影響。結果顯示：牛磺酸對高溫處理后神經管上皮細胞的存活具有保護作用。本實驗研究結果表明，牛磺酸對丙烯酰胺致SH-SY5Y細胞損傷有顯著的保護作用，說明牛磺酸對細胞具有很好的保護作用，能夠抑制丙烯酰胺的細胞損傷作用，推測牛磺酸對丙烯酰胺致細胞損傷的抑制作用通過兩種途徑來實現：a.牛磺酸與丙烯酰胺結合形成加合物，降低了細胞孵育液中丙烯酰胺的濃度，從而減弱其對細胞的損傷作用。作者已證實在化學反應體系中牛磺酸可與丙烯酰胺結合形成加合物［14］。b.牛磺酸具有抗氧化作用，能清除氧自由基，穩定細胞膜，減弱了丙烯酰胺對細胞造成的損傷作用。

4　結論

用濃度為50～200 μg/mL的牛磺酸對SH-SY5Y細胞孵育8 h，對細胞的生長無任何影響。用丙烯酰胺（300 μg/mL）對SH-SY5Y細胞孵育8 h，細胞存活率顯著下降；而經牛磺酸（50、100、200 μg/mL）保護后，細胞存活率顯著提高，LDH釋放量顯著降低。這表明牛磺酸在濃度為50～200 μg/mL時對丙烯酰胺誘導的SH-SY5Y細胞損傷具有保護作用，保護作用強弱依次為：中劑量組＞高劑量組＞低劑量組。

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Protective effects of taurine on SH-SY5Y cells injury induced by acrylamide

HAO Rui-fang1，JING Hao2，*
（1.Department of horticulture，Shanxi Forestry Vocational Institute，Taiyuan 030009，China；2.College of Food Science and Nutritional Engineering，China Agricultural University，Beijing 100083，China）

The preventive effects of taurine on acrylamide-induced cell injuries of human neuroblastoma cells（SH-SY5Y）were investigated by using cellular morphology，MTT assay and LDH assay.The results showed that the cell viabilities were decreased to 52%～81%when SH-SY5Y cells were incuvated 8 h with acrylamide of 100～700 μg/mL，which showed that acrylamide induced the cell membrane damage and LDH release outside cell membrane.The cell viability was decreased to 67.6%and LDH release rate was increased to 188.5%when SH-SY5Y cells were only incubated 8 h with acrylamide of 300 μg/mL in acrylamide injury group. However，when SH-SY5Y cells were pre-protected 1 h with taurine of 50，100 and 200 μg/mL before incubation 8 h with acrylamide of 300 μg/mL，taurine resulted in significant increases of SH-SY5Y cell viability to 81.6%，92.7%and 89.7%，and decreases of LDH release to 150.7%，138.8%and 113.3%as compared with that in acrylamide injury group.These demonstrated that taurine could protect SH-SY5Y cells from acrylamideinduced injury.

taurine；acrylamide；SH-SY5Y cells；injury

TS201.2

A

1002-0306（2015）20-0364-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.20.066

2015－01－30

郝瑞芳（1978-），女，博士，講師，研究方向：食品安全與質量控制，E-mail：471518969@qq.com。

景浩（1957-），男，博士，教授，研究方向：生物活性物質與功能性食品，E-mail：106263189@qq.com

國家自然科學基金資助項目（31171676）。