白屈菜紅堿對銅綠微囊藻生長和光合系統的影響

劉彥彥 邵繼海 劉德明 李錦龍 陳峻峰

(1. 湖南農業大學資源環境學院, 長沙 410128; 2. 湖南農業作物種質創新與資源利用國家重點實驗室培育基地,長沙 410128)

隨著現代工農業的發展, 許多水體呈現富營養化狀態, 水體富營養化導致水體中藻類過度繁殖,在水體中形成水華。20世紀90年代以來, 我國淡水水體富營養化日趨嚴重。2012年中國環境狀況公報顯示, 我國62個國控重點湖泊(水庫)中, Ⅳ以上的水體占有的比例高達38.7%。一些大型湖泊都先后暴發了嚴重的藍藻水華, 如滇池、太湖等。目前, 城市及周邊的小型水體有90%以上均處于富營養化和嚴重營養化水平, 藍藻水華頻頻暴發[1,2]。因此藍藻水華的削減與消除對于保證水體水質安全非常重要。

化學除藻是目前水體特別是小型水體, 藍藻水華去除的主要方法, 該方法具有除藻效果好、見效快的優點。然而, 絕大部分化學除藻劑如CuSO4、除草劑等會給環境帶來二次污染[3]。通過對水體環境中藻類生長繁殖機理的分析, 以及對各類抑藻技術優劣的比較, 生物源抑藻物質在抑藻方面的作用相對于化學方法具有安全和對水環境生態系統危害小等優點, 已引起各國學者的高度重視[4]。生物堿是存在于自然界中的一類含氮的天然有機化合物, 具有豐富的結構和生物活性多樣性。白屈菜紅堿是從中草藥白屈菜(Chelidonium majus L)中提取的一種具有顯著生理活性的生物堿, 具有多種藥理學作用,如抗腫瘤、抑菌、抗炎作用[5]等。銅綠微囊藻是我國最常見的水華藍藻種類, 也是產微囊藻毒素的主要種類之一。我們的研究結果顯示白屈菜紅堿對銅綠微囊藻具有很強的抑制作用, 因此利用白屈菜紅堿削減水體藍藻水華具有一定的應用潛力[6]。

光合放氧生物的葉綠素光誘導熒光與PSⅡ及反應中心電子供體側和受體側氧化還原狀態密切相關[7]。Strasser和Strasser[8]在生物膜能量流動理論基礎上建立了葉綠素光誘導熒光動力學曲線分析方法—JIP-test。JIP-test能較好的反應PSⅡ反應中心及電子供體側和受體側的生理狀態, 現已廣泛應用于環境脅迫對藍藻PSⅡ結構與功能的影響等方面的研究[9,10]。為了研究白屈菜紅堿對銅綠微囊藻生長和光合系統的影響, 本文探討了白屈菜紅堿脅迫下銅綠微囊藻生長、光合色素含量及葉綠素光誘導熒光動力學特征。本試驗為闡明白屈菜紅堿的抑藻機理提供了重要的信息。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗選用的銅綠微囊藻(Microcystis aeruginosa NIES-843)來自于日本國立環境研究所。藻株用CT完全培養基培養, 培養條件為光強30 μmol protons/(m2×s), 溫度(25±1)℃, 光周期12h︰12h (L︰D)。白屈菜紅堿(Chelerythrine)購自Sigma公司。

1.2 白屈菜紅堿抑藻試驗

用二甲基亞砜配制10、20、40、80、160、320 μg/mL的白屈菜紅堿母液。實驗在250 mL的三角瓶中進行,取各濃度的母液100 μL加入到無菌的CT培養基中, 另取100 μL二甲基亞砜做空白, 再向其中加入用CT培養的處于對數生長期的M. aeruginosa NIES-843, 終體積為100 mL, 白屈菜紅堿最終濃度為0、10、20、40、80、160、320 μg/L, M. aeruginosa NIES-843起始OD680值為0.090。所有處理均置于光強30 μmol protons/(m2×s),溫度(25±1)℃, 光周期12h︰12h(L︰D)條件下培養,在實驗的第2、第4、第6天取樣。藻細胞密度用血球計數板在顯微鏡下計數。藻細胞葉綠素和類胡蘿卜素用80%丙酮提取測定, 測定藻細胞OD450、OD645、OD663吸光值, 按照以下關系式計算: 葉綠素濃度Ca=12.72×A663—2.7×A645; 類 胡 蘿 卜 素 濃 度 Cx.c=4.1×A450—0.0435×Ca[11—12]。M. aeruginosa NIES-843葉綠素光誘導熒光多相瞬態上升動力學用Handy-PEA (Handy-Plant Efficiency Analyser, Hansatech Instruments, UK)測定, 熒光測定前所有樣品暗適應15min, 光化光強度為3000 μmol potons/(m2×s), 熒光瞬時上升曲線的記錄時間為50 μs—1 s, 采樣速率在前2 ms之內是105次/s,2 ms之后為103次/s[6]。

1.3 葉綠素熒光多相瞬態上升動力學參數分析

根據 Strasser和 Strasser[8]的能量流動模型, 分析 PSⅡ單位反應中心能量流動比活性能參數(ABS/RC、TR0/RC、ET0/RC)和 PSⅡ能量分配比率參數(ψ0、j P0、j E0)。各參數具體含義如表 1 所示[13]。

1.4 數據統計分析

實驗數據用SPSS 13.1進行線性回歸分析和單因素方差分析(One-Way ANOVA, LSD), P小于0.05被認為具有顯著差異。

表1 葉綠素熒光多相瞬態上升動力學參數Tab. 1 Parameters derived from polyphasic rise in chlorophyll fluorescence transients

2 結果

2.1 白屈菜紅堿對M. aeruginosa NIES-843生長的影響

圖 1顯示了白屈菜紅堿脅迫下 M. aeruginosa NIES-843在第2和第6天細胞數變化情況。在白屈菜紅堿脅迫的第 2天, 當濃度為 10 μg/L時, M.aeruginosa NIES-843的生長即受到顯著抑制。隨著白屈菜紅堿濃度增加, M. aeruginosa NIES-843生長被抑制的現象也愈加嚴重。到第6天, 10—80 μg/L白屈菜紅堿脅迫處理組的細胞數還是顯著低于對照,但是10—80 μg/L處理組間無明顯差異。采用SPSS 13.1分析軟件, 以白屈菜紅堿的濃度的對數值為橫坐標, 第2天白屈菜紅堿的生長抑制率為縱坐標, 做回歸分析和統計推斷, 得到第 2天白屈菜紅堿對 M.aeruginosa NIES-843 生長的EC50為(30.62±1.32) μg/L。

2.2 白屈菜紅堿對M. aeruginosa NIES-843細胞色素含量的影響

圖1 白屈菜紅堿脅迫對M. aeruginosa NIES-843細胞數(a)和生長抑制率-濃度回歸分析(b)的影響“*”代表 P<0.05; 下同Fig.1 Effect of chelerythrine stress on the cells and growth inhibition rate of M. aeruginosa NIES -843 (a) and the regress analysis of inhibitory rae versus Lg (concentration) on day 2 (b) “*” is P<0.05; the same applies bellow

圖2 白屈菜紅堿脅迫對M. aeruginosa NIES -843單位細胞內Chl.a含量(a)和類胡蘿卜素含量(b)的影響Fig. 2 Effect of chelerythrine stress on the cellular Chl. a contents (a) and cellular carotenoids contents (b) of M. aeruginosa NIES -843

圖2分別顯示了白屈菜紅堿脅迫下M. aeruginosa NIES-843單位細胞內 Chl. a和類胡蘿卜素含量在第2和第6 天的變化情況。單位細胞內Chl. a與類胡蘿卜素含量變化的趨勢基本相似。當白屈菜紅堿濃度為10和20 μg/L時, M. aeruginosa NIES- 843單位細胞內Chl. a與類胡蘿卜素含量在第2 與第6 天均顯著高于對照。在40 μg/L時, M. aeruginosa NIES-843單位細胞內Chl. a含量在第2 和第6 天均顯著高于對照,其類胡蘿卜素含量只有在第2 天顯著高于對照。當白屈菜紅堿濃度為 80和 160 μg/L時, M. aeruginosa NIES-843單位細胞內Chl. a與類胡蘿卜素含量都低于對照, 并且在160 μg/L時, M. aeruginosa NIES-843單位細胞內Chl. a含量顯著低于對照, 在第6 天, 該濃度下其類胡蘿卜素含量也顯著低于對照。

2.3 白屈菜紅堿脅迫下 M. aeruginosa NIES-843葉綠素光誘導熒光動力學特征

圖 3分別顯示了白屈菜紅堿脅迫下 M. aeruginosa NIES-843 葉綠素光誘導熒光多項瞬態上升動力學特征在第2和第6 天的變化情況, 均呈典型的O-J-I-P特征。各個濃度處理的葉綠素光誘導熒光多項瞬態上升動力學曲線均有典型的 J、I、P三個波峰。在第 2天, 各個濃度處理下的 M. aeruginosa NIES-843 葉綠素光誘導熒光都低于對照, 10、20 μg/L處理的OJIP曲線基本重合。到了第6天, 這種趨勢并沒有什么變化, 并且隨著濃度的升高, 低于對照的幅度越大。

2.4 白屈菜紅堿對M. aeruginosa NIES-843 PSⅡ單位反應中心能量流動比活性能的影響

圖4分別顯示了白屈菜紅堿脅迫下M. aeruginosa NIES-843 PSⅡ單位反應中心能量流動比活性能參數(ABS/RC、TR0/RC、ET0/RC)在第 2和第 6 天的變化情況。在白屈菜紅堿脅迫后的第 2 天, 白屈菜紅堿濃度為40 μg/L時, M. aeruginosa NIES-843 PSⅡABS/RC 值顯著高于對照, 濃度為40、80 μg/L時,M. aeruginosa NIES-843 PSⅡET0/RC 值顯著高于對照; 到了第 6 天, 白屈菜紅堿濃度為 20 μg/L時TR0/RC、ET0/RC 值都顯著低于對照, 白屈菜紅堿濃度為80 μg/L時, ABS/RC、TR0/RC 值顯著低于對照, 而ET0/RC 值卻顯著高于對照。

圖3 白屈菜紅堿脅迫下M. aeruginosa NIES -843葉綠素光誘導熒光動力學特征 (a. 2d; b. 6d)Fig. 3 Chlorophyll fluorescence transients of M. aeruginosa NIES -843 under chelerythrine stress (a. 2d; b. 6d)

圖4 白屈菜紅堿脅迫對M. aeruginosa NIES -843 PSⅡ單位反應中心能量流動比活性能參數的影響(a: 2d; b: 6d)Fig. 4 Effect of chelerythrine stress on the parameters of energy fluxes per reaction centre of M. aeruginosa NIES -843 PSⅡ(a: 2d; b: 6d)

圖5 白屈菜紅堿脅迫對M. aeruginosa NIES -843 PSⅡ單位反應中心能量流動比活性能參數的影響Fig. 5 Effect of chelerythrine stress on the parameters of energy fluxes per reaction centre of M. aeruginosa NIES -843 PSⅡ

圖 5顯示了白屈菜紅堿脅迫下 M. aeruginosa NIES-843 PSⅡ單位反應中心能量流動比活性能參數(RC/CS0)在第2和第6 天的變化情況。在白屈菜紅堿脅迫后的第 2 天, 白屈菜紅堿濃度為 40 μg/L時, M. aeruginosa NIES-843 PSⅡRC/CS0值顯著低于對照; 到了第6 天, 白屈菜紅堿濃度為40、80 μg/L時RC/CS0值都顯著低于對照。

2.5 白屈菜紅堿對M.aeruginosa NIES-843 PSⅡ能

量流動分配比率的影響

圖 6分別顯示了白屈菜紅堿脅迫下 M.aeruginosa NIES-843 PSⅡ能量分配比率參數(ψ0、j P0、j E0)在第 2 和第 6 天的變化情況。第 2 天, 在白屈菜紅堿濃度為40 μg/L時, ψ0值顯著高于對照,而j P0值顯著低于對照, 在白屈菜紅堿濃度為 10、20 μg/L時, j E0值顯著高于對照; 到了第6天, 在白屈菜紅堿濃度為 80 μg/L 時, ψ0、j P0、j E0值均顯著高于對照。

3 討論

通過線性回歸分析, 在第 2天白屈菜紅堿脅迫M. aeruginosa NIES-843生長的EC50為(30.62±1.32) μg/L。而幾種典型的生物源抑藻物質如連苯三酚(Pyrogallol) EC50為 650 μg/L, 壬酸(Nonanoic acid)EC50為 500 μg/L, 2-甲基乙酰乙酸乙酯 EC50為650 μg/L[14,15]。由此可見, 白屈菜紅堿是一種抑藻效應極強的生物源物質。

圖6 白屈菜紅堿脅迫對M. aeruginosa NIES -843 PSⅡ能量分配比率參數的影響(a: 2d; b: 6d)Fig. 6 Effect of Chelerythrine stress on the parameters of flux ratios of M. aeruginosa NIES -843 PSⅡ(a: 2d; b: 6d)

研究表明藻類和植物PSⅡ對環境脅迫很敏感,葉綠素熒光不僅能反映光能吸收、激發能傳遞和光化學反應等光合作用的原初反應過程, 而且與電子傳遞、質子梯度的建立及ATP的合成和CO2固定等過程有關。由于葉綠素光誘導熒光對環境脅迫響應非常靈敏, 所以葉綠素光誘導熒光動力學現在已被廣泛應用于植物和藍藻對環境脅迫的響應[14]。

根據Strasser和Strasser的能量流動模型圖, j P0可以反應 PSⅡ反應中心電子供體側的電子傳遞性能。在白屈菜紅堿脅迫的第二天, 當其濃度為40 μg/L時, j P0值顯著低于對照, j P0綜合了 ABS/RC 和TR0/RC 兩個指標, 即(TR0/RC)/(ABS/RC)。從圖 3可以看出, 當白屈菜紅堿濃度為 40 μg/L時,ABS/RC值顯著升高, 而TR0/RC值卻變化不大, 這說明此時單位反應中心吸收的光能顯著增加, 而單位反應中心捕獲的用于還原 QA的能量卻沒有很大變化, 由此我們可以推測, 微囊藻光合系統反應中心電子供體側電子為白屈菜紅堿作用的把位點之一。RC/CS0可以反應PSⅡ反應中心的狀態, 從圖5可以看出白屈菜紅堿脅迫導致了 RC/CS0的降低, 這說明PSⅡ反應中心也是白屈菜紅堿作用的把位點之一。ψ0可以反應 PSⅡ反應中心電子受體側的性能, 代表了光和系統電子傳遞超過 QA的概率。實驗結果顯示,在第2天, 在白屈菜紅堿各個處理濃度下ψ0值均高于對照, 并在20、40 μg/L時顯著高于對照。這一升高現象可能是因為M. aeruginosa NIES-843受到脅迫后需要更多的生物能來對抗脅迫, 而微囊藻 PSⅡ反應中心電子供體側受到損傷, 導致 PSⅡ反應中心電子受體側處于過氧化狀態, 進而引起ψ0值升高。