熒光原位雜交技術檢測PML／RARa融合基因在兒童APL微小殘留病中的應用

黃正剛，陳啟文，吳星恒

（南昌大學第一附屬醫(yī)院兒科，南昌330006）

熒光原位雜交技術檢測PML／RARa融合基因在兒童APL微小殘留病中的應用

黃正剛，陳啟文，吳星恒

（南昌大學第一附屬醫(yī)院兒科，南昌330006）

目的應用熒光原位雜交技術（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）定量檢測兒童急性早幼粒細胞白血病（acute promyelocyticleukemia，APL）PML／RARa融合基因，監(jiān)測患兒微小殘留白血?。╩inimal residual disease，MRD）。方法對初發(fā)、誘導緩解、鞏固、維持治療中的30例APL患兒進行常規(guī)形態(tài)學檢查、流式細胞術（flow cytometry，F(xiàn)CM）檢測及利用FISH進行PML／RARa融合基因定量檢測。結果30例初發(fā)骨髓細胞形態(tài)學及流式細胞術診斷為APL患兒，誘導化療結束后骨髓細胞形態(tài)學均完全緩解，F(xiàn)CM檢測MRD陽性19例，陰性11例，但FISH檢測PML／RARa融合基因陽性27例，陰性3例。經(jīng)鞏固治療后細胞形態(tài)學完全緩解，F(xiàn)CM檢測MRD陰性29例，1例持續(xù)陽性最終復發(fā)；而FISH檢測有7例PML／RARa融合基因檢查仍呈陽性，其中3例在第一輪維持治療后轉陰，4例仍呈陽性，經(jīng)IA方案化療后，1例轉陰，3例持續(xù)陽性者最終復發(fā)。兩種檢測方法陽性數(shù)比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.005）。結論FISH檢測PML／RARa融合基因較FCM具有更高的敏感度，可以定量檢測MRD，為早期預測復發(fā)，指導臨床治療提供依據(jù)。

熒光原位雜交技術；急性早幼粒細胞白血病，兒童；PML／RARa融合基因；微小殘留病灶

急性早幼粒細胞白血?。╝cute promyelocyticleukemia，APL）是一種特殊類型的白血病，90%以上患者均存在t（15；17）（q22；q21）的染色體易位，并在分子水平上形成PML／RARa融合基因，成為APL特有的分子遺傳學標志［1］。目前白血病的生存率雖然已明顯提高，但白血病復發(fā)仍是影響患者長期無病生存的重要因素，主要原因為在完全緩解患者的體內(nèi)仍存在微量殘留白血病細胞（minimal residual disease，MRD）。PML／RARa融合基因在白血病病程中比較穩(wěn)定，可用來監(jiān)測APL微量殘留白血病細胞的標志［2］。

本研究通過熒光原位雜交技術（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）檢測南昌大學第一附屬醫(yī)院30例兒童APL體內(nèi)PML／RARa融合基因在化療過程中表達水平的變化，監(jiān)測APL患兒體內(nèi)MRD，并與流式細胞術（flow cytometry，F(xiàn)CM）檢測相比較，分析MRD與患兒治療反應、預后等方面的相關性，為及時臨床用藥及預后評估提供實驗依據(jù)。

1 臨床資料

收集本院2008年1月至2013年1月經(jīng)FISH檢測PML／RARa融合基因陽性的APL 30例，男21例，女9例，平均年齡6.6歲，所有患者均按2010版兒童急性早幼粒細胞白血病臨床路徑化療。

2 方法

標本采集：分別在誘導治療第30天、鞏固治療后、每輪維持治療前各抽取骨髓液行骨髓細胞形態(tài)學、融合基因FISH和FCM檢查。

2.1 FISH檢測PML－RARA融合基因

2.1.1 骨髓標本的收集

將新鮮采集的骨髓1～2 m L置于快速準備好的肝素抗凝管內(nèi)，并立即顛倒混勻經(jīng)免肝素凝固，在室溫下保存24 h，標本中加入甘油可以長時間保存在－20℃。

2.1.2 標本預處理

1）低滲：用吸管將送檢標本轉移至15 m L離心管中，1 500 r·min－1離心10 min，去除上清，加入10 m L 4%的氯化鉀低滲液，用吸管用力吹打使細胞形成單細胞懸液，放置37℃的水浴箱中低滲20 min。

2）預固定：細胞低滲后，立即加入細胞固定劑0.5 m L，用吸管輕輕吹打混勻，在室溫放置2～3 min后，1 500 r·min－1離心10 min。

3）固定：離心后，去除液體，并加入10 m L細胞固定液10 m L，用吸管輕輕吹打混勻后，使細胞形成單細胞懸液，室溫放置20 min，1 500 r·min－1離心10 min。離心后去除上清，加入固定液再固定一次，方法同上。

4）滴片：將固定好的標本離心去上清后，用固定液調(diào)整到適量密度的細胞懸液，然后取1滴加到泡酸后的玻片上，并使細胞形成單細胞層，并對玻片進行標記。

5）細胞老化：將制備好的滴片標本放置70℃的烤片機或烤箱中老化2 h。

2.1.3 雜交

1）平衡：將老化的玻片標本放置在含2XSSC緩沖液中3 min。

2）梯度脫水：玻片標本平衡后，經(jīng)70%、85%以及100%的乙醇梯度脫水3 min，脫水后將玻片平放并使其自然干燥。

3）探針雜交液的準備：按每張玻片10∶1雜交液配置，取一EP管，按照下面的配方配置雜交液：雜交緩沖液7∶1，去離子水2.7，探針0.3∶1。探針雜交液經(jīng)過混勻后待用。

4）變性：將雜交液加到玻片樣本中央，蓋上蓋玻片，并用指甲油封片（用加鈣底油），然后放置在78℃的水浴箱中變性5 min。

5）雜交：取出雜交變性后的玻片，立即放置在42℃的濕潤的雜交盒中，雜交18～20 h。

2.1.4 洗滌

取出玻片，移去樣品玻片上的蓋玻片，立即放入68℃的0.4XSSC／0.3%NP－40洗滌液中，震蕩1～3 s，洗滌1～5 min后取出，然后放入室溫2XSSC／0.1NP－40洗滌液中，震蕩1～3 s，洗滌30 s后取出，將玻片放置于70%乙醇中3 min后取出，自然干燥。

2.1.5 封片觀察

1）將上述干燥的玻片加上1滴甘油，并蓋上蓋玻片封片。

2）封片后放置10 min，直接用熒光顯微鏡觀察，初發(fā)患者計數(shù)200個細胞，治療后監(jiān)測MRD計數(shù)1 000個細胞，進行結果判斷。

2.1.6 結果分析

正常細胞可見2個綠色信號及2個紅色的雜交信號；在細胞核中如出現(xiàn)的信號模式為1綠1紅2黃色（1G1R2F），或出現(xiàn)額外的紅色或綠色或1個單融合的信號模式為異常。

2.2 FCM檢測MRD

取肝素抗凝的骨髓，采用Ficoll－Hypaque密度梯度離心法常規(guī)分離單個核細胞，以活細胞直接免疫熒光法進行染色，流式細胞儀（美國BD公司）檢測5×105～5×106個細胞。將充分洗滌后的標本離心沉淀，除去紅細胞，加入熒光單抗（Mc Ab）孵育15 min后上機檢測。所用的Mc Ab均為美國BD公司提供的直標抗體，包括PE標記的CD10、CD19、CD13、CD34、CD33及FITC標記的HLA－DR、CD14、CD15、CD41。

陽性判定：以CD13、CD33抗原陽性細胞≥0.1%為陽性，≤0.1%為陰性［3］。

2.3 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)比較采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

誘導治療第30 d，30例初發(fā)病例經(jīng)骨髓細胞形態(tài)學檢查均已達完全緩解，F(xiàn)ISH檢測PML／RARa融合基因陽性27例；3個鞏固治療結束后，30例患兒骨髓細胞形態(tài)學檢查均為完全緩解，PML／RARa融合基因陽性7例；7例FISH檢測陽性患兒，在第一輪維持治療后轉陰3例，4例連續(xù)陽性者，給予IA方案化療，轉陰1例，3例持續(xù)陽性最終復發(fā)。30例誘導化療結束骨髓細胞形態(tài)學完全緩解患兒；FCM檢測MRD陽性19例、陰性11例，經(jīng)鞏固治療后FCM檢測MRD陰性29例，1例持續(xù)陽性最終復發(fā)。兩種檢測方法陽性數(shù)比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.005），見表1。

表1 30例APL患兒誘導30 d、鞏固化療后和3輪維持治療FISH和FCM檢測結果比較 例

4 討論

APL細胞存在染色體易位t（15；17）（q22；q21），形成PML／RARa融合基因，表達PML－RARa融合蛋白，該蛋白是APL發(fā)病的重要分子基礎［4－5］。PML／RARa融合基因是兒童APL中最常見的融合基因，可作為兒童APL診斷、治療、評估預后的標志。FISH技術作為一種新的分子遺傳學技術，具有操作簡單、快速、準確、直觀、方便、定量等特點［6］。

MRD是白血病患者經(jīng)化療達到臨床完全緩解后體內(nèi)殘留不同數(shù)量的白血病細胞狀態(tài)，殘留的白血病細胞是白血病復發(fā)的根源，因此，定期準確評估患者緩解期間體內(nèi)殘余的白血病細胞數(shù)量有利于對患者預后的判斷和治療方案的再選擇，是防止白血病復發(fā)和提高白血病患者長期生存率的重要措施。MRD目前常用的檢測手段包括細胞形態(tài)學、免疫學、細胞遺傳學、分子生物學等。初診APL患者體內(nèi)白血病細胞可達（1～4）×1012，經(jīng)化療緩解后骨髓細胞形態(tài)學白血病細胞≤5%，殘留的白血病細胞數(shù)仍達106～108，常規(guī)細胞形態(tài)學就難以檢出MRD［7］。常規(guī)細胞遺傳學分析因分裂相數(shù)量和質(zhì)量的限制，只能檢測中期細胞，因此也不是檢測MRD的敏感方法。

FISH是應用熒光物質(zhì)標記特異染色體上的基因作為探針識別染色體數(shù)目和結構異常的一種方法，是臨床上檢測PML／RARa融合基因非常有效的技術之一，也是監(jiān)測APL治療效果的敏感方法，在臨床上可用來APL的診斷和監(jiān)測MRD［8］。

白血病相關免疫表型（leukemi－aassociated immunophenotype，LAIP）是由系列交叉抗原表達、抗原表達不同步、過度表達、表達缺乏和（或）異位抗原表達引起，是區(qū)別白血病細胞與正常造血細胞的重要特征。有文獻報道［9］多數(shù)急性白血病患者復發(fā)時至少可以檢測到1個治療前的LAIP。因此，臨床上FCM同樣可以作為多數(shù)AML患者殘留病變監(jiān)測的重要方法。目前廣泛應用的四色多參數(shù)流式細胞術（MP－FCM）檢測白血病MRD的敏感度可達10－4，但免疫表型在白血病病程中會發(fā)生轉換和克隆演變，故可造成假陰性的問題；相對于MP－FCM而言，F(xiàn)ISH的靈敏度也可達10－3［10］，且以融合基因作為其檢測的靶分子穩(wěn)定可靠，不存在表型轉換和克隆演變而造成假陰性的問題，是目前MRD首選的檢測手段。因此，通過FISH技術定期、定量檢測APL中的PML／RARa融合基因，可以更靈敏、更精確地反映體內(nèi)白血病細胞的負荷及其變化趨勢，特別是對處于維持治療期間，用敏感特異的方法定期監(jiān)測MRD水平，對預后的判斷、早期預測復發(fā)、治療方案選擇、提高長期存活率等具有重要的臨床意義。在本組病例中，誘導化療第30天骨髓FCM檢測11例陰性，但PML／RARa融合基因檢測僅3例陰性，差異有統(tǒng)計學意義，說明FISH方法較FCM更加敏感、可靠。

有研究［11］證實MRD水平較其他預后因素能更好地反映患者白血病細胞對化療藥物敏感性等生物學因素的綜合效應，可作為臨床治療反應、疾病控制程度、患者是否達到分子學水平緩解的評估指標，較形態(tài)學標準、FCM確定緩解更加敏感。本研究通過FISH方法對30例APL患者誘導化療達完全緩解后進行PML／RARa融合基因定量分析，結果發(fā)現(xiàn)30例MRD檢測27例陽性，而FCM監(jiān)測MRD有19例陽性，提示誘導化療達到完全緩解能消滅患者體內(nèi)大量白血病細胞，腫瘤負荷明顯下降，但絕大部分仍有MRD。在誘導化療緩解后，常規(guī)骨髓形態(tài)學檢查不能反映患兒體內(nèi)白血病細胞的負荷及其變化，但FISH及FCM仍可追蹤到MRD。因此，對白血病患者需定期、定量監(jiān)測MRD，密切隨訪，對MRD持續(xù)陽性或MRD水平逐漸升高的患者應及時予強化治療，以防止復發(fā)。本組患者維持治療期間采用FCM監(jiān)測MRD 29例為陰性，1例持續(xù)陽性，經(jīng)IA方案化療后仍陽性最終復發(fā)；但FISH檢測，發(fā)現(xiàn)仍有7例標本MRD陽性，3例經(jīng)1輪維持治療后，MRD水平轉陰，4例持續(xù)陽性者，給予IA方案化療，1例轉陰，3例仍持續(xù)陽性最終復發(fā)；這可能是因為患者體內(nèi)白血病細胞的清除是個緩慢的、持續(xù)的過程，隨著維持治療的延長，MRD陽性率會逐漸降低，因此MRD陽性率的消長可作為調(diào)整化療方案的一項指標［12］；3例MRD持續(xù)陽性而復發(fā)，提示這種情況應密切觀察，及時調(diào)整化療方案。有研究［13］結果顯示PML／RARa融合基因檢測2次以上陽性者，100%復發(fā)。在本研究中FCM檢查在鞏固治療后僅1例持續(xù)陽性而復發(fā)，但FISH檢查仍可檢測部分病例MRD陽性，二者最終復發(fā)病例數(shù)比較差異有統(tǒng)計學意義，說明采用FISH監(jiān)測MRD敏感性及特異性強于FCM檢查。因此，F(xiàn)ISH作為PML／RARa融合基因的監(jiān)測技術，具有良好的敏感性及特異性，是兒童APL診斷及定期監(jiān)測MRD的可靠方法；定期檢測PML／RARa融合基因可以預測病情、及早發(fā)現(xiàn)APL在分子水平的復發(fā)，及時干預、指導臨床治療。本研究中標本較少，收集更大的樣本數(shù)進一步研究是非常必要的。

［1］ 蔣慧，朱嘉蒔.兒童急性早幼粒細胞白血病的治療進展［J］.中華實用兒科臨床雜志，2015，30（3）：161－164.

［2］ 仇飛，張輝，趙旭杰，等.免疫熒光動態(tài)監(jiān)測急性早幼粒細胞白血病患者PML－RARα融合蛋白變化［J］.中國組織工程研究，2012，16（10）：1875－1878.

［3］ Walter R B，Buckley S A，Pagel J M，et al.Significance of minimal residual disease before myeloablative allogeneic hemaopoietic cell transplant－Ation for AML in first and second complete remission［J］.Blood，2013，122（10）：1813－1821.

［4］ Powell B L，Moser B，tock W，et al.Arsenic trioxide improves event－free and overall survival for adults with acute promyelocytic leukemia：North American Leukemia Intergroup Study C9710［J］.Blood，2010，116（19）：3751－3757.

［5］ Scaglioni P P，Pandolfi P P.The theory of APL revisited［J］.Curr Top Microbiol Immunol，2007，313：85－100.

［6］ Choughule A，Polampalli S，Amre P，et al.Identification of PML／RARalpha fusion gene transcripts that showed no t（15；17）with conventional karyotyping and fluorescent in situ hybridization［J］.Genet Mol Res，2009，8（1）：1－7.

［7］ Ghanem H，Tank N，Tabbara I A.Prognostic implications of genetic aberrations in acute myelogenous leukemia with normal cytogenetics［J］.Am J Hematol，2012，87（1）：69－77.

［8］ 劉洋，雷婷，陳雙，等.急性早幼粒細胞白血病染色體易位聯(lián)合R顯帶和間期熒光原位雜交技術分析［J］.新疆醫(yī)科大學學報，2013，36（7）：938－941.

［9］ Xu F，Yin C X，Wang C L，et al.Immunophenotypes and immune markers associated with acute promyelocytic leukemia prognosis［J］.Dis Markers，2014，2014：421906.

［10］ Legües M E，F(xiàn)ranco G，Bertin P.Pilot study of PML／RAR alpha fusion by fluorescence in situ hybridization（FISH）method in acute promyelocyte leukemia［J］.Revista médica de Chile，2002，130（7）：737－744.

［11］ Willem se M J，Seriu T，Hettinger K，et al.Detection of minimal residual disease identif ies differences in treatment response between T－ALL and B－ALL［J］.Blood，2002，99（12）：4386－4393.

［12］ Murugaiyan G，Martin S，Saha B.Levels of CD40 expression on dendritic cells dictate tumour growth or regression［J］.Clin Exp Immunol，2007，149（1）：194－202.

［13］ Bennour A，Tabka I，Youssef Y B，et al.A PML／RARA chimeric gene on chromosome 12 in a patient with acute promyelocytic leukemia（M4）associated with a new variant translocation：t（12；15；17）（q24；q24；q11）［J］.Med Oncol，2013，30（1）：409.

（責任編輯：鐘榮梅）

R733.71

A

1009－8194（2015）11－0065－04

10.13764／j.cnki.lcsy.2015.11.027

2015－07－08

江西省衛(wèi)生廳科技計劃（20133032）