卡介菌多糖核酸對Nc/Nga小鼠特應性皮炎的保護作用

郭亞南 王麗麗 文海泉 任勇 李頌

卡介菌多糖核酸對Nc/Nga小鼠特應性皮炎的保護作用

郭亞南 王麗麗 文海泉 任勇 李頌

目的 探討卡介菌多糖核酸（BCG-PSN）對Nc/Nga小鼠特應性皮炎皮損的預防作用及可能機制。方法 外用二硝基氯苯（DNCB）反復刺激新生Nc/Nga小鼠，通過皮炎評分、搔抓行為、組織病理學、免疫學指標評價皮炎損傷程度，觀察BCG-PSN對小鼠皮損的預防作用。結果 出生后4周內重復注射BCGPSN，可以顯著改善DNCB致敏Nc/Nga小鼠皮損炎癥程度，降低皮炎評分以及小鼠的搔抓行為，不同濃度BCGPSN組之間搔抓頻率差異無統計學意義。BCG-PSN可以降低血漿中IgE的含量，呈劑量依賴性。0.5 mg/kg BCGPSN可增加皮損中分泌干擾素（IFN）γ的細胞數量。不同劑量BCG-PSN均可降低脾單一核細胞培養上清液中IL-4的含量，增加IL-12的濃度。結論 早期注射BCG-PSN可通過促進分泌IFN-γ的細胞增生，增加IL-12合成，降低IL-4和IgE的含量，從而預防Nc/Nga小鼠皮炎發生。

皮炎，特應性；小鼠，Nc/Nga；樹突細胞；卡介菌多糖核酸

卡介菌多糖核酸（BCG-PSN）是從卡介菌中提取多糖、核酸混合而制成的新型免疫調節劑，我們前期實驗發現，BCG-PSN可以促進AD患者PBMC中IL-12分泌，糾正Th1/Th2失衡狀態［1］。我們的動物實驗發現，BCG-PSN可能通過促進IL-12和IFN-γ分泌，抑制IgE合成，發揮治療Nc/Nga小鼠特應性皮炎樣皮損的作用［2］。早期注射BCG-PSN對于特應性皮炎是否有預防作用，經查閱文獻，未發現相關研究。我們采用日本Nc/Nga小鼠作為小鼠特應性皮炎模型，觀察BCG-PSN對Nc/Nga小鼠特應性皮炎皮損的影響，旨在為早期注射BCG-PSN預防特應性皮炎的發生提供依據。

材料和方法

一、動物與試劑

從日本Charles River Laboratories公司購得6周齡SPF級Nc/Nga小鼠（合格證號110600109000211），自由交配，選擇出生24 h內Nc/Nga幼鼠16只，3只母鼠所生，前4周以各自母鼠母乳喂養，4周后分籠飼養。飼養條件為清潔級環境，12 h光照/12 h黑暗，室溫為22～25℃，濕度為40%～70%，自由飲水進食。BCG-PSN購于湖南九芝堂醫藥貿易有限公司，二硝基氯苯（DNCB）購于北京市化學試劑公司，兔抗小鼠IFN-γ抗體和羊抗兔IgG（二抗）購于武漢博士德生物工程有限公司，小鼠 IL－4、IL－12、IgE 酶聯免疫檢測試劑盒購于美國Invitrogen公司。

二、方法

1.給藥：16只Nc/Nga新生小鼠分為3個組，正常對照組4只，低濃度組（0.1 mg/kg BCG-PSN）5只，高濃度組（0.5 mg/kg BCG-PSN）7 只。鼠齡 1、8、15、22 d：正常對照組小鼠分別于皮下注射生理氯化鈉溶液，低濃度組小鼠分別注射0.1 mg/kg BCG-PSN，高濃度組小鼠分別皮下注射0.5 mg/kg BCG-PSN。

2.皮損誘導：參考DNCB誘發Nc/Nga小鼠皮炎的文獻稍有改進［3-4］，鼠齡第49天，用含1%DNCB的丙酮溶液致敏各組Nc/Nga小鼠背部除毛后皮膚，第56、63、70天外用含0.1%DNCB的丙酮溶液進行激發。試驗過程中小鼠健康，未出現死亡。

3.觀察指標：

（1）皮損嚴重程度：第 57、64、71 天觀察小鼠，進行皮炎評分并拍照。皮炎評分按以下方法進行：觀察皮膚紅斑、鱗屑、表皮干燥、結痂等情況，按嚴重程度計分：無癥狀計0分、輕微計1分、中度計2分、嚴重計 3分，計算所有癥狀的分數［3］。

（2）小鼠搔抓行為：第 57、64、71天將小鼠單獨放置，觀察10 min內小鼠搔抓耳部、背部的次數，連續搔抓算作1次。

（3）血清 IgE 含量：第 57、64、71天眼眶后靜脈取血，抗凝血在4℃下1 600×g離心30 min，獲取血漿，凍存于-20℃，待測。采用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測血漿中細胞因子的濃度。

（4）Nc/Nga小鼠脾臟單一核細胞培養液中IL-4、IL-12的含量：小鼠脫頸處死后，無菌取脾臟置于消毒平皿中；取脾臟單一核細胞，調節細胞濃度為1×106/ml，接種至24孔培養板，培養48 h后收集上清液。用ELISA方法檢測IL-4、IL-12的含量。

（5）組織病理：第72天處死小鼠后，背部皮損組織用4%甲醛固定，石蠟包埋，HE染色后顯微鏡下觀察組織病理改變。

（6）Nc/Nga小鼠干擾素（IFN）γ的表達：用免疫組化法檢測小鼠組織病理中IFN-γ的表達水平。

4.統計學處理：SPSS 16.0統計軟件分析數據。計量資料以±s表示。多個樣本之間采用單因素方差分析，用方差齊性檢驗，如方差不齊，采用Dunnetts T3方法進行兩兩比較，如方差齊，采用Bonferroni分析，進一步比較兩兩之間差異。P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1.BCG-PSN對Nc/Nga小鼠皮炎評分的影響：早期接種BCG-PSN可以減輕由外用DNCB引起的皮炎。第57、64、71天，低濃度組皮炎評分與正常對照組相比，P值分別為 0.005、0.261、0.014，高濃度組與正常對照組相比，P值分別為0.000、0.002、0.000。第71天高濃度組與低濃度組之間差異有統計學意義，P＝ 0.013。見表1。

2.BCG-PSN對小鼠搔抓頻率的影響：早期注射低濃度BCG-PSN可以明顯降低DNCB致敏Nc/Nga小鼠搔抓頻率，與正常對照組比較，差異有統計學意義（P＝ 0.000、0.007、0.000），高濃度 BCG-PSN 明顯降低搔抓頻率，與正常對照組比較，差異有統計學意義（P＝ 0.00、0.00、0.00）。BCG-PSN兩個劑量之間差異無統計學意義，P＝ 0.058、0.074、0.051。見表2。

3.Nc/Nga小鼠各組第57、64、71天血漿IgE含量：早期多次注射BCG-PSN可以降低血漿中IgE的含量。第57、64、71天，低濃度組與正常對照組相比，P值分別為0.000、0.000、0.000；高濃度組與正常對照組相比，P值分別為 0.000、0.000、0.000。高濃度BCG-PSN能更有效的降低血漿內IgE的含量，第57、64、71天，高濃度組與低濃度組比較，P值分別為 0.001、0.009、1。見表 3。

表1 Nc/Nga小鼠各組不同時間皮炎評分（±s）

表1 Nc/Nga小鼠各組不同時間皮炎評分（±s）

注：a：與正常對照組比較，P ＜ 0.05；b：與低濃度組比較，P ＜ 0.05

組別 只數 57 d 64 d 71 d正常對照組 4 7±0.82 8.75±0.96 9.75±0.96低濃度組 5 4.8±0.84a 7.4±1.14a 7.6±1.14a高濃度組 7 4±0.82a 5.7±1.11a 5.71±0.78ab

表2 Nc/Nga小鼠各組搔抓頻率（±s）

表2 Nc/Nga小鼠各組搔抓頻率（±s）

注：a：與正常對照組比較，P＜0.05

組別 只數 57 d 64 d 71 d正常對照組 4 5±0.82 6.75±0.96 8.5±0.58低濃度組 5 2.4±0.55a 4.2±0.84a 4.8±0.84a高濃度組 7 1.23±0.76a 2.7±1.11a 3.43±0.98a

4.Nc/Nga小鼠各組脾單一核細胞培養上清液IL-4、IL-12的含量：Nc/Nga小鼠早期皮下注射低濃度、高濃度的BCG-PSN，均可降低DNCB激發的Nc/Nga小鼠脾臟單一核細胞培養上清液中IL-4的含量，與正常對照組相比，差異有統計學意義，P值分別為0.000、0.000。可增加IL-12含量，與正常對照組比較，差異有統計學意義，P值分別為0.000、0.000。高濃度BCG-PSN可明顯降低IL-4和提高IL-12的含量，與低濃度BCG-PSN比較，差異有統計學意義，P值分別為0.013、0.002，見表4。

表3 Nc/Nga小鼠各組第57、64、71天血漿IgE濃度（μg/L，±s）

表3 Nc/Nga小鼠各組第57、64、71天血漿IgE濃度（μg/L，±s）

注：a：與正常對照組比較，P ＜ 0.05；b：與低濃度組比較，P ＜ 0.05

組別 只數 57 d 64 d 71 d正常對照組 4 38.45±3.09 58.77±4.5 70.9±2.97低濃度組 5 25.2±4.77a 32.69±3.92a 39.38±4.8a高濃度組 7 16.09±1.9ab 24.38±3.51ab 37.15±4.68

表4 Nc/Nga小鼠各組單一核細胞培養上清液中IL-4、IL-12的含量（ng/L，±s）

表4 Nc/Nga小鼠各組單一核細胞培養上清液中IL-4、IL-12的含量（ng/L，±s）

注：a：與正常對照組比較，P ＜ 0.05；b：與低濃度組比較，P ＜ 0.05

組別 只數 IL-4 IL-12正常對照組 4 50.26±5.24 19.78±5.11低濃度組 5 32.56±4.62a 36.44±3.48a高濃度組 7 23.91±3.39ab 47.81±4.43ab

5.Nc/Nga小鼠各組背部皮膚組織病理學：正常對照組小鼠組織病理提示有角化過度、棘層肥厚、基底細胞空泡化，真皮增厚、較多淋巴細胞浸潤。早期多次注射低濃度BCG-PSN可以減少后期DNCB致敏Nc/Nga小鼠炎癥程度，表現為基底層細胞空泡化消失，真皮內稀疏淋巴細胞浸潤；早期多次注射高濃度BCG-PSN可以明顯減輕小鼠炎癥程度，組織病理圖片提示輕微角化過度，棘層恢復正常，真皮內散在少許淋巴細胞浸潤，見圖1～3。

6.Nc/Nga小鼠各實驗組背部皮損IFN-γ的表達：用高濃度BCG-PSN早期處理Nc/Nga小鼠，經DNCB致敏后，其真皮內有較多分泌IFN-γ的細胞，低濃度BCG-PSN早期處理的小鼠和正常對照組小鼠真皮內未見明顯的分泌IFN-γ的細胞。見圖4。

圖1 正常對照組小鼠背部組織角化過度、棘層肥厚、基底細胞空泡化，真皮增厚、較多淋巴細胞浸潤（HE×40）

圖2 低濃度組表現為基底層細胞空泡化消失，真皮內稀疏淋巴細胞浸潤（HE×40）

圖3 高濃度組提示輕微角化過度，棘層恢復正常，真皮內散在少許淋巴細胞浸潤（HE×40）

圖4 Nc/Nga小鼠背部皮損干擾素γ的表達（免疫組化 ×40） 正常對照組（4A）及低濃度組（4B）小鼠真皮內未見分泌IFN-γ的細胞，高濃度組（4C）小鼠真皮內有較多分泌干擾素γ的細胞

討 論

一些研究結果表明，BCG-PSN是較強的Th1型細胞因子活化劑，可以促進IFN-γ的表達。林恩堯等［4］研究表明，經BCG-PSN免疫的豚鼠，外周血的T淋巴細胞明顯增加，但是早期注射BCG-PSN是否可以防止過敏性疾病的發生未見相關報道。AD是一種慢性瘙癢性皮膚病，通常與過敏性鼻炎和哮喘等過敏性疾病相關［5-6］。Nc/Nga鼠是日本一種名叫Nishiki的寵物鼠，1997年Matsuda等對其進行了基礎和臨床研究，正式確立它作為AD模型。當Nc/Nga小鼠在普通環境下飼養時，它們在第8周開始出現搔抓行為，皮膚開始變得干燥并覆蓋鱗屑；在以后的幾個星期，小鼠的耳朵、背部、頸部和面部出現皮損。普通環境下Nc/Nga小鼠皮損免疫組化顯示有過度角化、棘層肥厚、角化不全，所有的這些表現與AD患者身上所觀察到的皮損非常相似［7-8］。小鼠皮損還提示有淋巴細胞浸潤、巨噬細胞浸潤，肥大細胞和嗜酸性粒細胞脫顆粒［9-11］。

我們前期實驗［2］利用DNCB重復刺激Nc/Nga小鼠皮膚，成功的建立特應性皮炎小鼠模型，由于部分小鼠在用5%DNCB刺激后，出現較為嚴重的潰瘍、出血。為避免出現類似結果，我們將Nc/Nga小鼠背部毛發除掉后，涂抹1%的DNCB致敏，0.1%的DNCB重復刺激3次。結果發現，正常對照組小鼠第1次重復刺激后，小鼠背部出現鱗屑、紅斑及皮膚干燥，第2次重復刺激后，小鼠背部出現紅斑、鱗屑，第3次重復刺激后，小鼠背部嚴重紅斑、厚痂。早期多次注射BCG-PSN可以緩解DNCB所致的皮炎嚴重程度，低濃度組小鼠早期出現少量抓痕和紅斑，后期皮膚干燥有較多鱗屑，未見明顯紅斑及結痂；高濃度組小鼠早期僅有皮膚干燥，后逐漸出現少許鱗屑。皮炎評分進一步證實，BCG-PSN對于特應性皮炎樣皮損有保護作用。早期多次注射低濃度和高濃度BCG-PSN可以明顯減少DNCB對成年Nc/Nga小鼠造成的搔抓行為，不同劑量BCG-PSN之間搔抓頻率無差異。我們的實驗還發現，早期多次注射BCG-PSN可以降低Nc/Nga小鼠血漿中IgE的含量，呈劑量依賴性。組織病理學提示正常對照組小鼠有過度角化、棘層肥厚、基底細胞空泡化，真皮增厚、有大量淋巴細胞浸潤；早期多次注射低濃度的BCG-PSN可以減少后期DNCB致敏Nc/Nga小鼠炎癥程度，表現為基底層細胞空泡化消失，真皮內淋巴細胞減少；早期多次注射高濃度BCG-PSN可以明顯減輕小鼠炎癥程度，組織病理圖片提示輕微角化過度，棘層恢復正常，真皮內稀疏淋巴細胞。以上結果說明，早期多次注射BCG-PSN對于Nc/Nga小鼠特應性皮炎樣皮損炎癥程度的改善有益。

Sugiura等［12］檢測5～28周齡普通環境下飼養的Nc/Nga鼠，發現皮損中分泌IL-4和IL-5的細胞明顯增多，并且隨周齡增長而增加，而分泌IFN-γ的細胞在21周前非常稀少，21周后才開始出現。Gately等［13］認為IL-12在免疫反應中可誘導IFN-γ產生，對IL-4的產生起抑制作用，從而誘導免疫反應朝著Th1型方向發展。IFN-γ有抑制Th2類細胞因子IL-4，IL-5的產生，促使Th0向Th1分化，抑制其向Th2分化的作用，并可阻斷IgE的合成，減少嗜酸性粒細胞的浸潤和活化。IFN-γ可以加強IL-12誘導Th1細胞產生的能力，而IL-12本身又能誘導IFN-γ的產生。這樣，形成一個正反饋的調節，加強了Th1的免疫反應，抑制了Th2的免疫反應［14］。我們通過免疫組化染色發現，高濃度BCG-PSN組小鼠皮損內分泌IFN-γ的細胞大量出現，而單一核細胞培養上清液中IL-4含量與正常對照組相比，明顯下降，IL-12的含量明顯增高。我們認為早期多次皮下注射高濃度的BCG-PSN，可誘導分泌IFN-γ細胞產生，促進IL-12分泌，抑制IL-4和IgE的合成，從而減輕皮損炎癥程度，發揮早期干預的作用。

［1］胡南,文海泉,肖嶸,等.卡介菌多糖核酸對特應性皮炎患者PBMC產生嗜酸粒細胞活化趨化因子和CCR3的表達［J］.中華皮膚科雜志,2006,39（11）:657-658.

［2］郭亞南,文海泉,張桂英,等.卡介菌多糖核酸對二硝基氯苯誘導的Nc/Nga小鼠特應性皮炎樣皮損的影響［J］.中華皮膚科雜志,2010,43（7）:497-500.

［3］Takano N,Sakurai T,Kurachi M.Effects of anti-nerve growth factor antibody on symptoms in the NC/Nga mouse,an atopic dermatitis model［J］.J Pharmacol Sci,2005,99（3）:277-286.

［4］林恩堯,王世珍,朱紹璋,等.卡介苗提取物調節慢性支氣管炎免疫功能效果的觀察［J］.中華結核和呼吸雜志,1987,10（1）:41-43.

［5］Akdis CA.New insights into mechanisms of immunoregulation in 2007［J］.J Allergy Clin Immunol,2008,122（4）:700-709.

［6］Akdis CA.Immune regulation by histamine H4 receptors in skin［J］.J Invest Dermatol,2008,128（7）:1615-1616.

［7］Vestergaard C,Yoneyama H,Matsushima K.The Nc/Nga mouse:a model for atopic dermatitis［J］.Mol Med Today,2000,6（5）:209-210.

［8］Vestergaard C,Bang K,Gesser B,et al.A Th2 chemokine,TARC,produced by keratinocytes may recruit CLA+CCR4+lymphocytes into lesional atopic dermatitis skin［J］.J Invest Dermatol,2000,115（4）:640-646.

［9］Yamashita H,Makino T,Mizukami H,et al.Pharmacological characterization of a chronic pruritus model induced by multiple application of 2,4,6-trinitrochlorobenzene in NC mice［J］.Eur J Pharmacol,2007,563（1-3）:233-239.

［10］Tanaka Y,Yamashita Y,Michikawa H,et al.Pharmacological characterization ofthebeta-adrenoceptorthatmediatesthe relaxant response to noradrenaline in guinea-pig tracheal smooth muscle［J］.Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol,2007,375（1）:51-64.

［11］Gao XK,Nakamura N,Fuseda K,et al.Establishment of allergic dermatitis in Nc/Nga mice as a model for severe atopic dermatitis［J］.Biol Pharm Bull,2004,27（9）:1376-1381.

［12］Sugiura K,Hiramoto K,Shamoto M,et al.Immunological cell situation in the skin of atopic model mice ［J］.J Eur Acad Dermatol Venereol,2004,18（2）:148-152.

［13］Gately MK,Gubler U,Brunda MJ,et al.Interleukin-12:a cytokine with therapeutic potential in oncology and infectious diseases［J］.Ther Immunol,1994,1（3）:187-196.

［14］Matsumoto M,Ra C,Kawamoto K,et al.IgE hyperproduction through enhanced tyrosine phosphorylation of Janus kinase 3 in Nc/Nga mice,a model for human atopic dermatitis ［J］.J Immunol,1999,162（2）:1056-1063.

Protective effect of polysaccharide nucleic acid fraction of bacillus Calmette-Guerin against atopic dermatitis in Nc/Nga mice

Guo Yanan*,Wang Lili,Wen Haiquan,Ren Yong,Li Song.*Shandong Provincial Hospital,Shandong University,Jinan 250021,China

Li Song,Email:123250349@qq.com

Objective To evaluate the protective effect of polysaccharide nucleic acid fraction of bacillus Calmette-Guerin（BCG-PSN）against atopic dermatitis（AD）in Nc/Nga mice,and to explore its possible mechanism.Methods Sixteen Nc/Nga mice were classified into normal control group （n=4）,low-concentration BCG-PSN group （n=5）and high-concentration BCG-PSN group （n=7）to be subcutaneously injected with sodium chloride physiological solution,BCG-PSN of 0.1 mg/kg and 0.5 mg/kg respectively,at 1,8,15 and 22 days of age.Dinitrochlorobenzene（DNCB）was repeatedly and topically applied to these Nc/Nga mice to induce AD-like lesions at 49 days of age.The preventive effect of BCG-PSN against AD was evaluated by dermatitis scores,scratching frequency,histopathological manifestations and immunological parameters（including IgE,interleukin（IL）-4 and-12,and interferon（IFN）-γ）.Results Repeated injection of BCG-PSN within 4 weeks after birth significantly decreased the severity of DNCB-induced AD-like lesions,dermatitis scores and scratching behavior in Nc/Nga mice.There was no statistical difference in scratching frequency between the high-and low-concentration BCG-PSN groups.BCG-PSN treatment reduced the plasma level of IgE in Nc/Nga mice in a dose-dependent manner.BCG-PSN at 0.5 mg/kg increased the number of cells secreting IFN-γ in skin lesions of mice.Both doses of BCG-PSN down-regulated IL-4 level,but up-regulated IL-12 level in the culture supernatant of spleen mononuclear cells from mice.Conclusion Early injection of BCG-PSN could protect Nc/Nga mice against dermatitis by promoting the proliferation of IFN-γsecreting cells,increasing the synthesis of IL-12,and reducing the levels of IL-4 and IgE.

Dermatitis,atopic;Mice,Nc/Nga;Dendritic cells;BCG-PSN

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.01.011

250021濟南，山東大學附屬省立醫院（郭亞南、任勇、李頌）；濟南市第五人民醫院（王麗麗）；中南大學湘雅二醫院（文海泉）

李頌，Email：123250349@qq.com

2014-06-24）

（本文編輯：吳曉初）