藥疹患者外周血單一核細胞中巨細胞病毒的檢測

李雙庚 陳官芝 肖君剛 王君 潘敏

藥疹患者外周血單一核細胞中巨細胞病毒的檢測

李雙庚 陳官芝 肖君剛 王君 潘敏

目的 探討人巨細胞病毒（CMV）感染在藥疹發病中的作用。方法 收集44例藥疹患者（其中重型藥疹13例）及50例健康對照外周血，Taqman實時熒光定量PCR（RT-PCR）檢測外周血單一核細胞中CMV DNA陽性率及載量；酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測血清CMV IgM陽性率。結果 44例藥疹患者CMV DNA陽性率（65.91%，29/44例）高于健康對照組（28.00%，14/50例），差異有統計學意義（χ2=13.552，P<0.05）；重型藥疹患者（11/13例）、輕型藥疹患者（58.06%，18/31例）及健康對照組CMV DNA陽性率不完全相等（χ2=16.153，P<0.05），其中重型組高于輕型組（χ2=13.817，P<0.05）及對照組（χ2=7.237，P<0.05）；藥疹患者CMV DNA載量（28 183.829±19 527.654）拷貝高于健康對照組（3 019.952±1 760.952）拷貝，差異有統計學意義（t′=8.517，P<0.05），重型藥疹患者（554 813.389 ± 722 642.498）拷貝、輕型藥疹患者（13 290.558±14 082.356）拷貝與對照組間CMV DNA載量差異無統計學意義（P>0.05）。藥疹患者CMV IgM陽性率（13.64%，6/44例）與健康對照組（6.00%，3/50例）差異無統計學意義（P>0.05）；輕型藥疹（6.45%，2/31例）、重型藥疹（4/13例）及健康對照組各組均數不完全相等（χ2=7.832，P<0.05），其中重型組高于對照組（χ2=6.409，P<0.05）。結論 藥疹患者存在CMV感染，CMV感染可能是藥疹發病或加重的因素之一。

藥疹；巨細胞病毒；巨細胞病毒感染

2.主要試劑：全血DNA提取試劑盒購于北京百泰克生物技術有限公司，pMD18-T載體、E.coliCompetent Cell JM109、Hind III限制酶、EASY Dilution購于寶生物工程（大連）有限公司，HotMaster PCR MasterMix購于北京天根生化科技有限公司，Taqman熒光定量PCR試劑盒購于北京康為世紀生物科技有限公司，CMV IgM ELISA試劑盒購于德國IBL公司。

3.引物及探針序列：參照文獻［8］設計CMV特異性引物和探針，由寶生物工程（大連）有限公司合成，CMV上游引物序列：5′-AACTCAGCCTTCCCTAAGACCA-3′，探針序列：5′-FAM-CAATGGCTGCAGTCAGGCCATGG-TAMRA-3′，下游引物序列：5′-GGGAGCACTGAGGCAAGTTC-3′，擴增產物 76 bp。

4.標本制備：采集藥疹患者急性期（發疹2～7 d）與健康對照晨起空腹靜脈血3 ml EDTA抗凝，提取外周血單一核細胞DNA，操作方法按試劑盒說明書進行，-20℃保存備用。同時采集藥疹患者與健康對照晨起空腹靜脈血3 ml，分離血清，-80℃保存用于ELISA。實驗所需的DNA陽性對照來自CMV B189病毒株，由青島大學醫學院張文卿教授惠贈。

5.方法：實時熒光定量PCR測定外周血單一核細胞CMV DNA陽性率及載量：反應體系為25 μl，含2×HotMaster PCR混合物 12.5 μl，上下游引物（20 μmol/L）各 1 μl，模板（CMV B189 病毒株 DNA）2 μl，ddH2O 8.5 μl。反應條件為 95 ℃預變性30 s；然后 95℃ 5 s，57℃ 30 s，共40個循環；最后 72℃延伸5 min。每份標本均做3次重復實驗取均值。反應結束后取PCR產物于2%瓊脂糖凝膠進行電泳（100 V，40 min），凝膠電泳掃描系統觀察電泳結果，證實為CMV及其特異性片段。

重組質粒克隆及質粒線性化：PCR擴增產物連接pMD-18-T載體后轉化入E.coliJM109感受態細胞內，37℃培養過夜（用X-gal/IPTG/Amp＋LB平板）得到大量轉化子；提取質粒DNA模板，用HindⅢ限制酶進行線性化處理，PCR抽提、乙醇精制后得到標準品DNA。觀察標準品DNA電泳結果及測定A值。產物測序所得序列與基因庫比對，結果表明擴增片段重組后無變異發生。

實時熒光定量PCR檢測臨床標本：將構建的CMV標準品 DNA（107拷貝/μl）用 EASY Dilution 按 10 倍梯度稀釋（0、101、102、103、104、105倍）作為模板，進行實時 PCR 反應，制作標準曲線，并對臨床標本進行檢測。反應體系為20 μl，含2 × GoldStar TaqMan Mixture 10 μl，上下游引物（20 μmol/L）各 0.4 μl，探針 0.8 μl，模板 2 μl，RNase 淡水 6.4 μl。反應條件為95℃預變性30 s；然后95℃ 5 s，57℃ 30 s，共40個循環；最后72℃延伸5 min。每份標本均做3次生物學重復實驗，每次實驗設陽性對照及陰性對照，陰性對照用RNase-淡水替換模板DNA。反應結束后取PCR產物于2%瓊脂糖凝膠進行電泳，得到預期擴增片段。

PCR復制效率、檢測的準確性及重復性：構建的標準品DNA可以得到較好的擴增曲線、標準曲線。CMV標準曲線相關系數0.993，擴增效率0.908，可以在較寬的范圍內進行準確定量，且3個平行樣品重復性好。

ELISA法檢測血清CMV IgM陽性率：參照試劑盒說明書進行，每份標本均做3個復孔。

6.統計學方法：SPSS19.0軟件進行統計處理，定量檢測結果以±s表示，2組間均數比較采用t′檢驗，3組間均數比較采用秩和檢驗；定性數據用率表示，組間率的比較采用χ2檢驗。

二、結果

1.CMV DNA陽性率檢測：44例藥疹患者CMV DNA陽性率為 65.91%（29/44），健康對照組為 28.00%（14/50），兩組比較差異有統計學意義（χ2=13.552，P<0.05）。重型患者（11/13例）、輕型患者（58.06%，18/31例）、健康對照組CMV DNA陽性率依次遞減，各組總體率不等或不完全相等（χ2=16.153，P<0.05），其中重型組高于輕型組（χ2=13.817，P<0.0167）及對照組（χ2=7.237，P<0.0167），見表 1。

2.CMV DNA載量檢測：44例藥疹患者CMV DNA載量拷貝高于健康對照組拷貝，差異有統計學意義（t′=8.517，P<0.05）；重型藥疹患者拷貝、輕型藥疹患者拷貝、健康對照組CMV DNA載量依次遞減，但差異無統計學意義（P>0.05）。見表 1。

3.藥疹患者組與健康對照組CMV特異性IgM檢測：藥疹患者CMV IgM陽性率（13.64%，6/44例）與健康對照組（6.00%，3/50例）差異無統計學意義（P>0.05）；輕型藥疹（6.45%，2/31例）、重型藥疹（4/13例）及健康對照組各組均數不完全相等（χ2=7.832，P<0.05），其中重型組高于對照組（χ2=6.409，P<0.0167），見表 1。

表1 藥疹患者與健康對照CMV DNA及CMV IgM檢測（例）

三、討論

CMV又名人皰疹病毒5型（HHV-5），可引起感染細胞形成巨細胞，能在唾液腺、腎和單核吞噬細胞系統中建立潛伏感染，與HHV-6及HHV-7同屬β皰疹病毒亞科，基因組具有同源性，抗原性亦有部分交叉，宿主范圍窄，生長周期長［9］。有報道，藥疹的發生與病毒感染有關，特別是人皰疹病毒和人免疫缺陷病毒［1］。LeClaire 等［10］報道的傳染性單核細胞增多癥患者使用氨芐西林等抗生素治療，常導致全身性麻疹樣皮疹，當傳染性單核細胞增多癥急性期消退后再用這些藥物治療，患者麻疹樣皮疹不復發。Kano等［5］研究發現，藥物超敏反應綜合征患者癥狀于停用病因藥物之后仍持續發展并轉為遷延化，原因除了特定的藥物及遺傳因素之外，此類患者體內存在潛伏感染病毒的再激活，主要是人皰疹病毒。

本文結果顯示，藥疹患者組CMV DNA陽性率及病毒載量高于健康對照組；與健康對照比較，CMV DNA陽性率有隨藥疹病情加重升高趨勢，提示CMV感染可能與藥疹有關，CMV可能為導致藥疹發病或加重的一個危險因素。但CMV DNA載量無論在重型藥疹患者、輕型藥疹患者及健康對照組間差異無統計學意義，推測CMV感染參與藥疹的發生發展可能并不需要較高的病毒量維持。

特異性IgG和IgM檢測是區分CMV潛伏感染和活動性感染最為常用的指標。藥疹患者血清中病毒特異性抗體的測定作為研究病毒與藥疹關系的有效手段已被國外學者廣泛應用，CMV特異性IgM抗體的出現提示活動性CMV感染。本文結果顯示，重型藥疹患者組IgM陽性率明顯高于健康對照組，提示藥疹患者特別是重型藥疹患者可能存在活動性CMV感染。

總之，CMV原發感染后可在體內長期潛伏，一定條件下可被激活，導致機體免疫系統功能紊亂，可能成為藥疹的促發因素加快疾病的發展進程。本文結果提示：藥疹患者中存在CMV的活動性感染和DNA陽性率及病毒載量增加，CMV感染可能是影響藥疹發病及加重的環境因素之一。

［1］朱桂芝,陳官芝,羅兵.藥疹患者Epstein-Barr病毒感染的檢測［J］.中華皮膚科雜志,2009,42（8）:556-559.

［2］楊婷婷,朱桂芝,陳官芝,等.藥疹病人EB病毒和人皰疹病毒6型感染檢測［J］.青島大學醫學院學報,2009,45（4）:347-352.

［3］張洋,陳官芝,朱桂芝,等.藥疹患者人類皰疹病毒7型感染的檢測［J］.中華皮膚科雜志,2014,47（6）:397-399.

［4］Carr A,Vasak E,Munro V,et al.Immunohistological assessment of cutaneous drug hypersensitivity in patients with HIV infection［J］.Clin Exp Immunol,1994,97（2）:260-265.

［5］Kano Y,Hiraharas K,Sakuma K,et al.Several herpesviruses can reactivate in a severe drug-induced multiorgan reaction in the same sequential order as in graft-versus-host disease［M］.Br J Dermatol,2006,155（2）:30l-306.

［6］Shiohara T,Inaoka M,Kano Y.Drug-induced hypersensitivity syndrome （DIHS）:a reaction induced by a complex interplay among herpesviruses and antiviraland antidrug immune responses［J］.Allergol Int,2006,55（1）:1-8.

［7］趙辨.中國臨床皮膚病學［M］.南京:江蘇科學技術出版社,2009:751-761.

［8］Watzinger F,Suda M,Preuner S,et al.Real-time quantitative PCR assays for detection and monitoring of pathogenic human viruses in immunosuppressed pediatric patients ［J］.J Clin Microbiol,2004,42（11）:5189-5198.

［9］Pascher A,Klupp J,Schulz RJ,et al.CMV,EBV,HHV6,and HHV7 infections after intestinal transplantation without specific antiviral prophylaxis［J］.Transplant Proc,2004,36（2）:381-382.

［10］LeClaire AC,Martin CA,Hoven AD,et al.Rash associated with piperacillin/tazobactam administration in infectious mononucleosis［J］.Ann Pharmacother,2004,38（6）:996-998.

Detection of cytomegalovirus in peripheral blood mononuclear cells of patients with drug eruptions

Li Shuanggeng,Chen Guanzhi*,Xiao Jungang,Wang Jun,Pan Min.*Department of Dermatology,Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College,Qingdao 266003,China

Chen Guanzhi,Email:chenguanzhi@outlook.com

Objective To investigate the role of human cytomegalovirus （CMV）in the occurrence of drug eruptions.Methods Peripheral blood samples were collected from 44 patients with drug eruptions（including 13 severe cases） and 50 healthy human controls.Taqman fluorescent real-time quantitative PCR （RT-PCR） was performed to determine the positive rate and load of CMV DNA in peripheral blood mononuclear cells（PBMCs）.Enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）was conducted to detect anti-CMV IgM antibodies in sera.Results The positive rate of CMV DNA was significantly higher in the patients than in the controls（65.91% （29/44）vs.28.00%（14/50）,χ2=13.552,P<0.05）,significantly different among patients with severe drug eruptions（11/13）,patients with mild drug eruptions（58.06%（18/31））and the controls（χ2=16.153,P<0.05）.In addition,patients with severe drug eruptions showed a higher positive rate of CMV DNA compared with patients with mild drug eruptions（χ2=13.817,P<0.05）and the controls（χ2=7.237,P<0.05）.CMV DNA load was significantly higher in the patients than in the controls（（28 183.829 ± 19 527.654）vs.（3 019.952 ± 1 760.952）copies,t′=8.517,P<0.05）.No significant difference was found in CMV DNA load between patients with severe drug eruptions（（554 813.389 ± 722 642.498）copies）,patients with mild drug eruptions （（13 290.558 ± 14 082.356）copies））and the controls（P>0.05）.The positive rate of anti-CMV IgM antibodies was similar between the patients and controls（13.64%（6/44）vs.6.00%（3/50）,P>0.05）,but significantly different among patients with severe drug eruptions（4/13）,patients with mild drug eruptions（6.45%,2/31）and the controls（χ2=7.832,P<0.05）,and significantly higher in patients with severe drug eruptions than in the controls （χ2=6.409,P<0.05）.Conclusions CMV infection exists in patients with drug eruptions,and might be a factor associated with the initiation and aggravation of drug eruptions.

Drug eruptions;Cytomegalovirus;Cytomegalovirus infections

我們前期研究［1-3］結果表明，EB病毒和人類皰疹病毒6型及7型（HHV-6，HHV-7）感染與藥疹的發生相關。近年來藥疹的病毒感染因素受到重視，活動性病毒感染可改變機體的免疫調節功能，增加免疫系統的敏感性［4］。有學者發現，在藥物超敏反應綜合征患者中，可以觀察到人類皰疹病毒的激活增殖［5］。這些病毒在體內可互相關聯，一種病毒的激活復制可導致其他病毒的激活復制［6］。我們用Taqman實時熒光定量PCR檢測外周血單一核細胞中巨細胞病毒（CMV）DNA陽性率及載量，酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測定血清CMV IgM陽性率，探討CMV感染在藥疹發生中的作用。

一、對象與方法

1.臨床資料：2011年9月至2013年7月青島大學附屬醫院、青島市膠州中心醫院皮膚科門診和住院藥疹患者44例，其中女20例，男24例，年齡17～63歲，平均（40.79±17.72）歲。所有患者均有明確的服藥史，在服藥后2 h至7 d（平均4.03 d）出現皮疹，符合藥疹的診斷和分型標準［7］。其中重型藥疹13例，包括超敏反應綜合征1例、Steven-Johnson綜合征2例、大皰性表皮松解型4例、剝脫性皮炎型6例。輕型藥疹31例，包括固定型、麻疹型或猩紅熱型、蕁麻疹型、多形紅斑型等臨床常見類型。致敏藥物有：青霉素或頭孢類17例，占38.64%；磺胺類3例，占6.82%；解熱鎮痛藥11例，占25.00%；抗癲癇藥5例，占11.36%；別嘌醇1例，占2.27%；中藥或中成藥7例，占15.91%。選擇同期體檢者50例作為健康對照組，其中男、女各25例，年齡18～68歲，平均（41.96±15.17）歲，兩組性別和年齡差異無統計學意義（均P>0.05）。本研究通過青島大學附屬醫院倫理委員會批準，受試者均簽署知情同意書。

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.01.020

青島市公共領域科技支撐計劃項目（09-1-1-24-nsh）

266003青島大學附屬醫院皮膚科［李雙庚（現在青島市膠州中心醫院皮膚科，266300）、陳官芝、肖君剛、王君、潘敏］

陳官芝，Email：chenguanzhi@outlook.com

2014-05-20）

（本文編輯：吳曉初）