窄譜中波紫外線對特應性皮炎患者外周血血清胸腺基質(zhì)淋巴細胞生成素、白細胞介素25及其受體的影響

李玉娟 江勇 李慧卿 王秀敏

·論著·

窄譜中波紫外線對特應性皮炎患者外周血血清胸腺基質(zhì)淋巴細胞生成素、白細胞介素25及其受體的影響

李玉娟 江勇 李慧卿 王秀敏

目的 探討窄譜中波紫外線（NB-UVB）對特應性皮炎（AD）患者血清胸腺基質(zhì)淋巴細胞生成素（TSLP）、白細胞介素 25（IL-25）及外周血單一核細胞（PBMC）TSLP受體（TSLPR）mRNA、IL-25受體（IL-25R）mRNA表達水平的影響。方法 AD患者40例，采用NB-UVB照射治療，雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測治療前后血清中TSLP、IL-25水平；反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）法檢測治療前后PBMC TSLPR mRNA、IL-25R mRNA的表達水平。采用歐洲的AD評分標準（SCORAD）評估疾病嚴重程度，視覺模擬標尺法（VAS）評價瘙癢程度。選取30例健康體檢者作為對照。組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，治療前后比較采用配對t檢驗。結(jié)果 患者組經(jīng)NB-UVB照射后總有效率達75%（30/40），治療后SCORAD評分（20.36±5.12）及VAS評分（3.05±1.02）均較治療前（分別為55.26±10.88和8.20±1.37）明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義（t值分別為 10.29和 8.16，P＜0.05）。AD 患者組治療前血清 TSLP［（198.24±29.47）ng/L］、IL-25含量（160.54±34.89 ng/L）及 TSLPR mRNA（8.57±1.34）、IL-25R mRNA（6.81±0.50）相對表達量均明顯高于健康對照組［分別為（120.13±19.65）ng/L、（120.41±43.07）ng/L、1.94±0.39、1.48±0.47］，差異均有統(tǒng)計學意義（t值分別為 29.70、14.65、7.07、18.89，P ＜ 0.05）。NB-UVB 治療顯著改善病情后，患者血清 TSLP［（151.87 ± 14.78）ng/L］、IL-25 含量［（130.52 ± 29.65）ng/L］及 PBMC TSLPR mRNA（2.89 ± 0.53）、IL-25R mRNA（3.90 ± 0.37）相對表達量較治療前明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義（t值分別為18.56、9.07、5.21、7.35，均P＜0.05）。治療后血清TSLP、IL-25含量，PBMC TSLPR mRNA、IL-25R mRNA相對表達量與健康對照組相比，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。結(jié)論 TSLP、IL-25可能在AD的發(fā)病中起重要作用，NB-UVB下調(diào)TSLP、IL-25及其受體的表達可能是NB-UVB治療AD的機制之一。

皮炎，特應性；紫外線；胸腺基質(zhì)淋巴細胞生成素；白細胞介素25

以往的研究表明，Th1/Th2細胞平衡失調(diào)在特應性皮炎（atopic dermatitis，AD）發(fā)生中起重要作用，急性期Th2細胞占優(yōu)勢，Th1細胞受抑制。近年來發(fā)現(xiàn)，上皮細胞衍生的細胞因子胸腺基質(zhì)淋巴細胞生成素（thymic stromal lymphopoietin，TSLP）、白細胞介素25（IL-25）均為Th2型細胞因子，可促進Th2型免疫應答［1］。窄譜中波紫外線（NB-UVB）治療 AD 有較好療效［2］，但其作用機制尚不明確。本實驗通過檢測AD患者NB-UVB治療前后TSLP、IL-25及其受體的變化情況，探討NB-UVB治療AD的機制。

資料與方法

一、臨床資料

選取我院門診40例AD患者，符合Williams診斷標準［3］，其中男 19 例，女 21 例；年齡 14 ～ 40（25.8 ±10.57）歲，病程11～38（18±7.34）年。患者治療前1周停抗組胺藥及外用糖皮質(zhì)激素、免疫調(diào)節(jié)劑；4周內(nèi)未系統(tǒng)使用糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑，未經(jīng)過光療或光化學治療；既往無光敏感及眼部病變，無嚴重心、肺、肝、腎等疾病。健康對照組為健康志愿者30例，男 16例，女 14例，年齡 15～38（23.8±9.70）歲，個人及家族中均無遺傳過敏史，兩組受試者性別及年齡差異均無統(tǒng)計學意義。本實驗經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會批準。

二、主要試劑與儀器

人TSLP、IL-25 ELISA試劑盒為美國RD公司產(chǎn)品；總RNA提取液RNAisoTMPlus、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit、SYBR Green 熒光定量PCR試劑盒為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。NBUVB光療儀為德國Waldmann公司產(chǎn)品。

三、方法

1.NB-UVB治療：NB-UVB照射的初始劑量為最小紅斑量的50%，即0.3～0.4 J/cm2，每周照射3次。照射時戴專用目鏡，并保護外生殖器及非皮損區(qū)，照射距離約20 cm。如照射皮膚無紅斑反應，以后每次劑量增加20%，至出現(xiàn)淡紅斑維持該劑量，療程12周，共照射36次，最大劑量2.5 J/cm2。若出現(xiàn)疼痛性紅斑則暫停照射，在紅斑消退后恢復照射，劑量減少50%，照射總次數(shù)不變。為防皮膚干燥，每次治療后予以潤膚乳外用。

2.療效判斷：采用歐洲的AD計分系統(tǒng)（scoring atopic dermatitis，SCORAD）［4］對嚴重程度進行評估，包括皮損范圍、皮損嚴重程度、瘙癢和影響睡眠程度。皮損范圍（A）：頭頸部、臂各9%，軀干前、后各13.5%，下肢各22.5%；1%的面積為1分，最大評分100分；皮損嚴重程度（B）：采用0～3四級評分法，包括紅斑、丘疹或水腫、滲出或結(jié)痂、表皮剝脫、苔蘚化、皮膚干燥（評價未受累皮膚）共6項體征，根據(jù)皮損輕重程度分級，最大分值18分；瘙癢和影響睡眠程度（C）：按最近的3個晝夜平均計分，每項評分各為0～10分。計算公式為：總分=A/5+7B/2+C。采用視覺模擬標尺法（visual analogue scale，VAS）評價瘙癢程度（0為無瘙癢，10為劇烈瘙癢）。

記錄治療前后SCORAD積分和VAS積分。根據(jù)SCORAD積分計算積分下降指數(shù)：積分下降指數(shù)（%）=［（治療前SCORAD積分-治療后SCORAD積分）/治療前SCORAD積分］×100%。痊愈：積分下降指數(shù)＞90%；顯效：積分下降指數(shù)70%～90%；有效：積分下降指數(shù)30%～69%；無效：積分下降指數(shù)＜30%。總有效率=痊愈率+顯效率+有效率。

3.實驗方法：分別抽取患者治療前后及健康對照者肘靜脈血5 ml。EDTA抗凝，其中2 ml以2 500×g離心5min，取上清液，待ELISA檢測；3ml應用Ficoll密度梯度離心法1 000×g離心20 min，取上中層界面處的白色云霧層狹窄帶，待RT-PCR法檢測。標本均置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

（1）實時RT-PCR檢測外周血單一核細胞（PBMC）中TSLP受體（TSLPR）mRNA、IL-25受體（IL-25R）mRNA的表達：①RNA提取：采用RNAisoTMPlus提取液嚴格按照說明書步驟提取。紫外分光光度儀測定RNA純度，A260/A280比值控制在1.8～2.2之間；②反轉(zhuǎn)錄：參照試劑盒說明進行，反轉(zhuǎn)錄體系：PrimeScript緩沖液 2 μl，PrimeScript RT混合酶Ⅰ 0.5 μl，Oligo dT 引物 0.5 μl，Random 6 mers 0.5 μl，dT 引物 0.5 μl，總 RNA 500 ng，用 RNase Free dH2O 將體積調(diào)整為 10 μl，逆轉(zhuǎn)錄條件：37 ℃ 15 min，85℃5s；③SYBRGreen 實時定量 PCR：TSLPRmRNA引物：上游 5′-GCACACTGGCAATGTAATGC-3′，下游 5′-GTTGAACAGAACAAGTGACC-3′；IL-25R mRNA 引物：上游 5′-CCTTCCCGGACTGGTTCATT G-3′，下游 5′-AAGCCCCAGTCCCAGGTTTAC-3′；內(nèi)參選取β肌動蛋白引物：上游5′-AGAGCCTCGC CTTTGCCGATCC-3′，下游 5′-CATGCCGGAGCCGT TGTCGAC-3′。實驗步驟參照說明書進行；PCR反應體系：SYBR Premix Ex TapTM12.5 μl，上游引物 0.5 μl，下游引物0.5 μl，模板2 μl。參照說明書設定PCR程序：95℃30 s預變性，然后95℃5 s，60℃30 s，72℃30 s重復40個循環(huán)進行擴增。反應結(jié)束后，設定最佳閾值，獲取每個標本的Ct值，根據(jù)儀器給出的標準曲線及斜率，獲得目的基因的相對表達指數(shù)。

（2）ELISA法檢測血清中TSLP、IL-25濃度：采用ELISA試劑盒，建立標準曲線，酶標儀測定450 nm處A值，根據(jù)標準曲線讀取樣品濃度。

4.統(tǒng)計學方法：采用SPSS19.0軟件處理。各項數(shù)據(jù)均以±s表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，治療前后采用配對t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

一、臨床療效

40例AD患者均完成治療，其中痊愈3例，顯效14例，有效13例，無效10例，總有效率75%。治療后 SCORAD（20.36±5.12）和 VAS評分（3.05±1.02）均較治療前（分別為55.26±10.88和8.20±1.37）明顯下降，治療前后比較，差異均有統(tǒng)計學意義（t值分別為10.29和8.16，均 P＜0.05）。

二、NB-UVB治療前后AD患者血清TSLP、IL-25含量測定

治療前AD患者組TSLP、IL-25含量明顯高于健康對照組（表1），差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；NB-UVB治療后，均較治療前明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；治療后與健康對照組比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

三、NB-UVB治療前后 AD患者 PBMC中TSLPR mRNA、IL-25R mRNA的檢測

治療前 AD患者組 TSLPR mRNA、IL-25R mRNA相對表達量均明顯高于健康對照組（表1），差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；NB-UVB治療后，均較治療前明顯降低（P＜0.01）；治療后與健康對照組相比，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表1 窄譜中波紫外線治療對特應性皮炎患者血清胸腺基質(zhì)淋巴細胞生成素（TSLP）、白細胞介素25（IL-25）及其受體mRNA相對表達量的影響

討 論

TSLP主要由上皮細胞分泌，能夠促進B淋巴細胞生長、分化及T細胞增殖［5］，并對樹突細胞（DC）的活化、分化、成熟和遷移起著重要的調(diào)控作用［6］，是啟動過敏反應的重要因子。其受體TSLPR主要表達于DC、單核細胞和某些T細胞表面。研究證實［7］，TSLP在DC極化促進Th2細胞因子產(chǎn)生過程中發(fā)揮重要作用。上皮細胞經(jīng)過敏原刺激后TSLP表達上調(diào)，TSLP能夠活化CD11c+DC，被TSLP激活的DC（TSLP-DC）還可以啟動CD4+T細胞前體向Th2轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生Th2生成傾向的微環(huán)境，分泌Th2型細胞因子，從而觸發(fā)過敏性炎癥反應。

IL-25是IL-17家族成員之一，主要由活化的Th2細胞和抗原刺激后的上皮細胞產(chǎn)生。研究顯示［8-9］，腹腔注射 IL-25 至小鼠體內(nèi)能誘導 IL-4、IL-5和IL-13等細胞因子產(chǎn)生，介導Th2型免疫反應的發(fā)生。IL-25在Th2細胞介導的免疫反應的起始和維持階段皆起重要作用。TSLP-DC刺激Th2記憶細胞表達IL-25R上調(diào)，而在IL-25存在的情況下，TSLP-DC活化的Th2記憶細胞分泌的Th2型細胞因子水平升高［10］。TSLP與IL-25共同刺激Th2記憶細胞增殖，在TSLP-DC驅(qū)動的Th2記憶細胞擴增期間通過上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子GATA-3、C-MAF和JunB的基因表達，增強Th2細胞極化和細胞因子的產(chǎn)生，導致Th1/Th2細胞平衡失調(diào)。

本實驗發(fā)現(xiàn)，AD患者 TSLP、IL-25及 TSLPR mRNA、IL-25R mRNA水平明顯高于健康對照組，提示兩者參與了疾病的發(fā)生。AD患者存在皮膚屏障功能障礙，與 IL-25 的活性有關［11］。Hvid 等［12］研究發(fā)現(xiàn)，IL-25能抑制角質(zhì)形成細胞合成角質(zhì)纖絲聚集蛋白，從而破壞皮膚屏障功能，促進炎癥的發(fā)生。綜上所述，我們認為上皮細胞經(jīng)過敏原刺激后上調(diào)TSLP、IL-25表達，促進炎性細胞因子的分泌，促進Th2型免疫應答，同時Th2型細胞因子影響皮膚的屏障功能，使皮膚環(huán)境因子如過敏原、刺激物及微生物高度敏感，進一步加劇皮膚炎癥反應。

中國AD診斷和治療指南中指出，紫外線是治療AD的有效方法且以NB-UVB的療效最佳［13］。有資料顯示［14］，NB-UVB 照射后 AD 患者 Th2、Th22 和Th1介導的免疫反應受抑制，使其異常分化和增殖趨于正常，表皮的屏障功能正常化。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，AD患者經(jīng)過NB-UVB治療后，臨床療效尚可，TSLP、IL-25及TSLPR mRNA、IL-25R mRNA水平較治療前明顯降低，治療后與健康對照組相比較，差異無統(tǒng)計學意義。推測NB-UVB照射治療通過降低TSLP、IL-25及其受體水平，使Th2細胞的分化、增殖及Th2型細胞因子的生成均受到抑制，有效減弱了Th2型免疫反應及表皮屏障功能障礙，從而減輕皮膚炎癥反應，改善癥狀。NB-UVB照射后TSLP、IL-25及其受體水平降低的具體機制仍需進一步闡明。

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·學術動態(tài)·

外周血中的細菌DNA觸發(fā)了銀屑病的發(fā)生

銀屑病作為一種系統(tǒng)性自身免疫性炎癥性疾病，在免疫學方面與克羅恩病等炎癥性疾病有相似之處。研究發(fā)現(xiàn)，細菌DNA片段能誘導克羅恩病的免疫反應。盡管大多數(shù)銀屑病患者血細菌培養(yǎng)均為陰性，仍提出銀屑病患者外周血中的細菌DNA片段觸發(fā)了疾病的發(fā)生并誘導了炎癥反應的假說。通過對外周血的檢測發(fā)現(xiàn)，斑塊狀銀屑病患者血液中細菌DNA陽性率較滴狀、反向型銀屑病和健康對照組明顯升高；細菌DNA陽性患者外周血中炎癥因子IL-1β、IL-6、IL-12、TNF和INF-γ表達水平較陰性患者和健康對照組明顯升高；細菌DNA陽性患者發(fā)病年齡更早，病史更長。基因測序發(fā)現(xiàn)，大部分細菌DNA片段來源于大腸桿菌，其余的DNA片段也主要來源于腸道中的常見菌群。這些結(jié)果證實了銀屑病患者腸道屏障通透性增加的假說，也證實細菌DNA的遷移在斑塊狀銀屑病發(fā)病機制中起著重要作用。［JAMA Dermatol,2015,151（6）:670-671］（成都市第二人民醫(yī)院皮膚科 張力文陳濤摘譯）

Effects of narrow-band ultraviolet B on the expressions of thymic stromal lymphopoietin,interleukin-25 and their receptors in peripheral blood of patients with atopic dermatitis

Li Yujuan*,Jiang Yong,Li Huiqing,Wang Xiumin.*Department of Dermatology,Second Hospital of Tianjin Medical University,Tianjin 300211,China

ObjectiveTo explore the effects of narrow-band ultraviolet B （NB-UVB）on the serum levels of thymic stromal lymphopoietin （TSLP）and interleukin-25 （IL-25）,as well as on the expressions of TSLP receptor（TSLPR）and IL-25 receptor（IL-25R）mRNAs in peripheral blood mononuclear cells （PBMCs）from patients with atopic dermatitis（AD）.MethodsA total of 40 patients with AD and 30 healthy volunteers were enrolled in this study.All the patients were treated with NB-UVB at 0.3－2.5 J/cm2thrice a week for 12 consecutive weeks.Venous blood samples were obtained from these patients before and after the treatment as well as from these healthy controls.Doubleantibody sandwich enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）was performed to detect serum levels of TSLP and IL-25,and reverse transcription PCR（RT-PCR）to determine the mRNA expression levels of TSLPR and IL-25R in PBMCs from these subjects.The scoring atopic dermatitis（SCORAD）system developed by the European Task Force on Atopic Dermatitis was used to estimate the severity of AD,and visual analogue scale （VAS）to evaluate the degree of itch.Statistical analysis was carried out by the two-independent-samplet-test for intergroup comparisons and pairedt-test for comparisons between pre-and post-treatment samples from these patients.ResultsAfter the treatment with NB-UVB,the total response rate reached 75%（30/40）in these patients,with a significant decrease in SCORAD score from 55.26±10.88 before the treatment to 20.36±5.12 after the treatment（t=10.29,P＜0.05）and in VAS score from 8.20±1.37 to 3.05±1.02（t=8.16,P＜0.05）.Before the treatment,the patients showed a significant increase in the serum levels ofTSLP（198.24±29.47 ng/L vs.120.13±19.65 ng/L,t=29.70,P＜0.05）and IL-25（160.54±34.89 ng/L vs.120.41±43.07 ng/L,t=14.65,P＜0.05）,as well as in the mRNA expression levels of TSLPR （8.57±1.34 vs.1.94±0.39,t=7.07,P＜0.05）and IL-25R（6.81±0.50 vs.1.48±0.47,t=18.89,P＜0.05）compared with the healthy controls.With the improvement of conditions after the treatment,a significant decrease was observed in the serum levels of TSLP（151.87±14.78 ng/L,t=18.56,P＜0.05）and IL-25（130.52±29.65 ng/L,t=9.07,P＜0.05）,as well as in the mRNA expression levels of TSLPR （2.89±0.53,t=5.21,P＜0.05）and IL-25R （3.90±0.37,t=7.35,P＜0.05）in PBMCs from these patients compared with those before the treatment,and differences disappeared in all of these parameters between the patients and controls（allP＞0.05）.Conclusions TSLP and IL-25 may play important roles in the development of AD,and NB-UVB may treat AD by downregulating the expressions of them and their receptors.

Dermatitis,atopic;Ultraviolet rays;Thymic stromal lymphopoietin;Interleukin-25

Wang Xiumin,Email:wangxiumin@medmail.com.cn

作者單位：300211天津醫(yī)科大學第二醫(yī)院皮膚科（李玉娟、江勇）；山東省博興縣第二人民醫(yī)院（李慧卿）；濱州醫(yī)學院附屬醫(yī)院皮膚科（王秀敏）

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.08.008

王秀敏，Email：wangxiumin@medmail.com.cn

2014-11-24）

（本文編輯：顏艷）