超臨界CO2微乳法制備鹽酸小檗堿脂質體工藝的考察與優化

程泓波，劉為為，張少華，曹 婷，牟 晨，禮 彤

(沈陽藥科大學制藥工程學院，遼寧沈陽 110016)

鹽酸小檗堿［1］(Berberine Hydrochloride B.H)又稱黃連素，屬于異喹啉類生物堿，作為抗菌藥，廣泛用于治療胃腸炎、細菌性痢疾等。隨著研究的深入，人們發現它還可以治療心律失常、高血壓、高脂血癥、糖尿病、腫瘤等疾病，然而研究也發現鹽酸小檗堿體內抑瘤作用沒有體外明顯，可能因其腸道吸收較差，在體內很難達到對腫瘤細胞直接作用的較高血藥濃度。而且鹽酸小檗堿靜脈給藥可能引起藥疹、過敏反應、血紅蛋白及血紅細胞減少、藥敏性休克等副作用，1982年以來我國已明令禁止使用鹽酸小檗堿靜脈給藥。因此，如何發揮鹽酸小檗堿在癌癥治療上的效果，抑制其副作用是我們面臨的一大問題。脂質體［2］是一種新的給藥系統，靜脈注射脂質體后，脂質體很快被網狀內皮系統(RES)攝取，增加藥物局部濃度，提高藥物療效，降低或減少藥物的不良反應。

目前制備鹽酸小檗堿脂質體有薄膜分散法［3］和pH梯度法［4］等，但此法制備工藝復雜，有機溶劑使用量大，限制了鹽酸小檗堿脂質體的工業化生產。筆者采用超臨界CO2流體技術［5］制備鹽酸小檗堿脂質體旨在探索一條環保、無污染、工藝簡單的新方法路線，為其工業化生產提供可能性。

1 儀器與材料

CLJ-B-120-35-1超臨界流體設備(沈陽東宇藥物技術研究院超臨界制造分公司)，TU-1810紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)，WJL激光粒度儀(蘇州江東精密儀器有限公司)，AR2130電子分析天平(美國 Ohaus公司)，PHS-3C酸度計(中國 LIDA instrument公司)，透析袋(截留分子質量8 000～14 000 U，美國Scientific Research-Special公司)，恒溫磁力攪拌器(南匯電訊器材廠)，臺式離心機80-2(常州國華電器有限公司)。

鹽酸小檗堿原料藥(質量分數≥98%，四川什邡華安藥物原料有限公司);鹽酸小檗堿標準品(中國藥品生物制品檢定所，批號110713-200609);CO2(食品級，沈陽景泉氣體廠);LipoidS100天然大豆磷脂(SPC，質量分數≥94%，德國Lipoid公司);無水乙醇、膽固醇、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉(天津大茂化學試劑廠);蒸餾水(沈陽藥科大學自產)。

2 方法與結果

2.1 磷酸鹽緩沖液的配置 精密稱取Na2HPO4·12H2O 0.37 g，NaH2PO4·2H2O 2.0 g，溶于適量蒸餾水中，定容至1 000 mL，并用NaHCO3溶液調節pH=7.0，得磷酸鹽緩沖液(PBS)。

2.2 超臨界CO2微乳法制備鹽酸小檗堿脂質體用適量無水乙醇溶解一定配比(3∶1)的大豆磷脂(SPC，磷脂濃度30 g·L-1)和膽固醇(Chol)，得溶液A，將鹽酸小檗堿(藥脂比1∶4)加至PBS中，進行充分攪拌得溶液B。將A，B混合液超聲混勻得乳黃色懸濁液，將此懸濁液置于超臨界設備中，在相應條件下進行制備，反應結束后，恒速泄壓得澄清半透明黃色鹽酸小檗堿脂質體。

2.3 鹽酸小檗堿含量測定方法

2.3.1 檢測波長的確定 分別稱取適量的鹽酸小檗堿和空白脂質體溶于磷酸鹽緩沖液(pH=7)—無水乙醇(體積比2∶3)的混合溶劑A中，并以混合溶劑A為空白，在波長200～400 nm內進行紫外掃描，如圖1和圖2所示，鹽酸小檗堿共有242、268、345 nm三個吸收峰，而空白脂質體在近紫外端243 nm處有吸收，遠紫外端345 nm處沒有紫外吸收，故空白脂質體在345 nm處無紫外干擾，最終確定345 nm為紫外分光光度法測定鹽酸小檗堿含量的檢測波長。

2.3.2 標準曲線的制作 精密稱取鹽酸小檗堿標準品20 mg，加入pH=7.0磷酸緩沖液使其完全溶解，稀釋并定容至100 mL后，再將該溶液用pH=7.0磷酸緩沖液稀釋成 0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 mg·L-1的標準溶液，于345 nm波長處測定其各自的吸光度。結果表明，在0.25～8.0 mg·L-1濃度范圍內，鹽酸小檗堿的吸光度A與其濃度C呈線性關系，回歸方程為 A=5.361×10-2C+1.840×10-3，r=0.999 0。

2.3.3 精密度與穩定性實驗 取高、中、低3種濃度(8.0、2.0、0.25 mg·L-1)鹽酸小檗堿標準溶液，連續測定5次，得日內精密度RSD(n=5)分別為1.32%、1.02%和1.36%。連續測5 d，得到日間精密度RSD(n=5)分別為1.10%、1.35%和1.38%。結果表明，用紫外分光光度法測定鹽酸小檗堿含量精密度，穩定性均良好。

2.3.4 回收率實驗 精密量取0.5 mL空白脂質體溶液，分別加入高、中、低濃度(8.0、2.0、0.25 mg·L-1)鹽酸小檗堿標準溶液，用溶劑A定容至25 mL，并在波長345 nm處測定吸光度，計算回收率。所得平均回收率分別為100.30%、99.89%和100.04%，RSD分別為0.16%、0.18%和1.74%，符合規定。

2.4 鹽酸小檗堿脂質體包封率的測定 超臨界CO2微乳法制備鹽酸小檗堿脂質體，目的在于提高鹽酸小檗堿脂質體被動載藥的包封率，并增加其載藥量，使得鹽酸小檗堿脂質體有可能達到抑瘤所需要的血藥濃度，同時降低給藥體積，增加生物安全性。因此本文以脂質體包封率為實驗指標。

選擇無鹽酸小檗堿的脂質體透析溶液為參比，采用紫外可見分光光度計在波長345 nm處測量透析［6］后游離的鹽酸小檗堿的含量，通過下式計算出脂質體的包封率(EE%):

式中 m1——脂質體中鹽酸小檗堿的總質量

m2——游離鹽酸小檗堿質量

2.5 超臨界CO2流體制備鹽酸小檗堿脂質體的工藝考察

2.5.1 壓力對鹽酸小檗堿脂質體包封率的影響由圖3可見，隨著制備壓力的增加，包封率呈先增后減的趨勢。分析認為當系統處于亞臨界狀態時，隨著體系CO2含量的增加，CO2氣體小分子進入脂質體雙分子層內部溶脹形成球形膠質結構，當處于超臨界CO2狀態時，加壓過程有利于形成膠束，此過程包封率增加顯著。脂質體膠束屬于溶液體系，壓力對系統影響不如對亞臨界的氣體系統影響大，但是過高的壓力，會使膠束破裂，造成脂質體泄漏致使包封率減少。

2.5.2 溫度對鹽酸小檗堿脂質體包封率的影響由圖4可見，隨著制備溫度的升高，脂質體包封率呈先增后減的趨勢，而變化趨勢尤其在相變溫度的附近增減較為明顯，分析認為膜分子運動隨著溫度的增加而加快，相變溫度是脂質體膜由“凝膠態”轉變為“液晶態”，其磷脂分子疏水鏈由“全反式”向“扭曲態”過渡，其紊亂度及活動度增加，疏水鏈縱向長度減少，膜分子間距增加;膜通透性增大，包封率增大，相變時脂質體會發生相分離(phase separation)，即凝膠相和液晶態會同時存在，當凝膠相和液態相同時存在時，磷脂結構域間距最大，此時膜通透性最大，但是超過玻璃轉換溫度，即磷脂全部以液態相存在時，膜的流動性更高，包封藥物的釋放速度也增大，包封率下降。

2.5.3 孵化時間對鹽酸小檗堿脂質體包封率的影響 由圖5可見，當系統剛進入超臨界狀態時，隨著體系CO2含量的增加，脂質體雙分子層形成球形膠質結構—溶液膠束過渡形態，隨著孵化時間的延長，脂質體膠束溶液形成，此時是一種相對穩定的體系，包封率最高，過長的平衡時間使脂質體表面張力下降，內部分子交聯，不利于膠束的穩定性，包封率下降。

表1 Box Behnken法因素水平表

表2 Box Behnken法實驗方案與結果

2.6 Box Behnken優化鹽酸小檗堿脂質體制備工藝 根據單因素研究，篩選出壓力、溫度、孵化時間為優化對象，采用Box Behnken法優化鹽酸小檗堿脂質體的超臨界制備工藝，以包封率為響應值，標準順序中1～12號為析因實驗，13～17為5個中心實驗，用于估計實驗誤差，實驗設計見表1，方案與結果見表2。

采用design expert8.0響應面對實驗數據進行回歸分析，其中二次多項式回歸擬合度最高，并且更好地表征了不同因素之間的交互作用，采用二次多項式回歸擬合，建立二次多元回歸方程，對該方程的回歸分析和方差分析結果見表3。

由表3可知，EE%和自變量之間的線性關系極明顯，該模型回歸極顯著(P＜0.000 1)，失擬項不顯著，并且該模型R2=0.988 5，說明該模型與實驗擬合良好，其中自變量A、B、C、AB、BC、B2與響應值之間線性關系顯著，自變量A2，C2與響應值之間線性關系極顯著，可以用于該模型的理論推測，由F檢驗可以得到因子貢獻率為:A2＞C2＞＞C＞B2＞BC＞AB＞A＞B，推斷超臨界操作條件對包封率的影響:壓力＞時間＞溫度。AB，BC交互作用顯著;AC之間交互作用不顯著，詳見圖6～8。

表3 包封率響應結果回歸分析與方差分析表

Box Behnken設計優化超臨界操作最佳條件為壓力19.59 MPa，溫度52.78℃，孵化時間1.81 h，實驗預測值該操作條件下最佳包封率為59.29%。在該壓力下進行驗證試驗，得到最佳包封率為59.35%，平均包封率為59.26%，實驗值與預測值吻合，見表4。

2.7 鹽酸小檗堿脂質體粒徑的測定 粒徑及分布是影響脂質體在體內行為、物理穩定性和臨床應用安全性的重要指標。粒徑大小及其分布是影響脂質體在體內靶向性，物理穩定性的重要指標，是脂質體質量控制的關鍵之一。本文采用了激光粒度儀對鹽酸小檗堿脂質體的粒徑及分布進行了測定，結果如圖9。由圖9所示，鹽酸小檗堿脂質體分布均勻且集中，平均粒徑1.304 μm，粒徑分布0.3 ～3 μm。

3 討論

盡管早在20世紀60年代初，國外就開始了脂質體的研究，但目前真正上市的脂質體并不多。脂質體劑型對制備條件的變化很敏感，為了保證最終順利過渡到大生產，打好堅實的研究基礎是很有必要的。對于關鍵的工藝條件和工藝步驟應進行驗證，說明工藝的合理性和重現性。在脂質體的制備過程中，常使用有一定毒性的氯仿，甲醇等有機溶劑來溶解磷脂，這些均限制了其在工業化中的生產。

雖然薄膜分散法等方法［7］制備的脂質體包封率較高，但工藝復雜和有機溶劑的大量使用均限制了其工業化生產。目前靜態的超臨界CO2技術在制備固體分散體中應用較廣泛［8］，而在有關制備脂質體的研究較少，本實驗制備的鹽酸小檗堿脂質體僅使用少量乙醇最大程度降低了有機溶劑的使用，無環境污染和溶劑殘留，且工藝簡單，傳質速率高，有利于孵化過程中藥物分子從膜外向膜內擴散［9］，同時超臨界CO2在一定溫度下經高壓作用形成，體系中的高壓同樣有利于藥物進入脂質體內水相，進而提高脂質體的包封率，增大載藥量。張志麗等［6］用超臨界法制備鹽酸小檗堿脂質體時，考察了藥脂比和磷脂濃度對脂質體包封率和載藥量的影響，得到了包封率為73.1%，載藥量為16.15%的脂質體，這為鹽酸小檗堿脂質體的工業化生產提供了更大的可能性。

4 結論

在超臨界條件下，分別考察了制備壓力、溫度、時間對鹽酸小檗堿脂質體包封率的影響，并采用Box Behnken設計優化超臨界CO2制備鹽酸小檗堿的最佳條件:壓力19.59 MPa，溫度52.78℃，孵化時間1.81 h，預測包封率為59.29%，而實驗包封率為59.35%，平均包封率為59.26%，實驗值與預測值吻合。并初步考察了脂質體的粒徑大小和分布:平均粒徑1.304 μm，粒徑分布 0.3 ～3 μm。

采用超臨界CO2流體技術制備鹽酸小檗堿脂質體，旨在探索一種條件溫和、工藝簡單、綠色環保的新方法，提高鹽酸小檗堿脂質體被動載藥的包封率，增加載藥量從而使其有可能達到治療所需的較高血藥濃度，同時降低副作用。實驗表明，超臨界流體制備鹽酸小檗堿脂質體是可行的，操作簡單，無溶劑殘留，且在操作條件可以控制脂質體的粒徑大小，提高脂質體穩定性［10-11］，為其實現工業化生產提供了可能，若要提高其包封率和載藥量，還需進一步考察研究。

［1］ 王雪超，杜美容.鹽酸小檗堿溶解度與相分配系數研究［J］.河北北方學院學報(自然科學版)，2011，27(1):26-29.

［2］ 崔福德主編.藥劑學［M］.7版.北京:人民衛生出版社，2011:402-410.

［3］ 金 青，趙文英，張國雨，等.注射用鹽酸小檗堿脂質體的制備［J］.醫藥導報，2011，30(3):353-355.

［4］ 牟琳琳，徐 洋，蔣宮平，等.改良pH梯度法制備鹽酸小檗堿脂質體［J］.中國藥學雜志，2013，48(1):49-53.

［5］ 徐少洪，趙 斌，閆志強，等.超臨界流體技術在脂質體制備中的應用［J］.材料導報，2014，28(5):98-102.

［6］ 張志麗，張少華，張志云，等.響應面設計優化超臨界CO2法制備鹽酸小檗堿脂質體的處方工藝［J］.沈陽藥科大學學報，2012，29(10):747-752，811.

［7］ 王興慧，李俊生，呂佳佳，等.鹽酸小檗堿脂質體的制備工藝優選及體外釋放性質考察［J］.中國實驗方劑學雜志，2013，19(18):39-42.

［8］ 張 維，張志云，張志麗，等.超臨界流體技術制備固體分散體的研究進展［J］.安徽醫藥，2013，17(6):903-905.

［9］ Lesoin L，Boutin O，Crampon C，et al.CO2/water/surfactant ternary systems and liposome formation using supercritical CO2:A review［J］.Colloids and Surfaces A:Physicochemical and Engineering Aspects，2011，377(1/3):1-14.

［10］安學勤，裘 丹，沈偉國，等.超臨界二氧化碳法制備納米鹽酸小檗堿脂質體的方法:中國，101683322A［P］.2010-03-31.

［11］ Meure LA，Foster NR，Dehghani F.Conventional and dense gas techniques for the production of liposomes:a review［J］.AAPS PharmSciTech，2008，9(3):798-809.