正交試驗優選歡天安神飲的水提工藝

郭華 李文 趙穎 朱維娜

（南京市中醫院，江蘇南京 210001）

正交試驗優選歡天安神飲的水提工藝

郭華 李文 趙穎 朱維娜

（南京市中醫院，江蘇南京 210001）

目的：研究歡天安神飲中部分藥物的水提工藝，優選提取工藝條件。方法：采用L9（34）正交試驗設計，以飲片中（-）-丁香樹脂酚-4-O-β-D-呋喃芹糖基-（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖苷和丹酚酸B的提取率為考察指標，以浸泡時間、加水量、提取次數、提取時間等為考察因素，采用HPLC法測定，所得的結果進行方差分析，綜合兩個指標結果確定最佳工藝。結果：此復方中合歡皮、丹參等藥物確定的最佳水提工藝條件為：加飲片總量25倍量的水分3次提取，每次1.5h。結論：優選的工藝穩定，方法可行。

歡天安神飲 提取工藝 正交試驗

1 儀器與試藥

1.1 儀器1290型安捷倫超高效液相色譜儀；紫外檢測器；電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司生產；KQ-500型醫用超聲清洗器，昆山市超聲儀器有限公司生產；水浴鍋，上海躍進醫療器械廠生產；RV10旋轉蒸發器（IKA）。

1.2 試藥（-）-丁香樹脂酚-4-O-β-D-呋喃芹糖基-（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖苷對照品（中國藥品生物制品檢定所），供含量測定用，批號：111911-201101；丹酚酸B對照品（中國藥品生物制品檢定所），供含量測定用，批號：111562-201212；甲醇、乙腈為色譜純；其余所用試劑均為分析純，均購自上海化學試劑有限公司；水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結果

2.1 正交試驗設計采用L9（34）正交表進行正交設計，對浸泡時間、加水量、提取次數、提取時間進行考察，以（-）-丁香樹脂酚-4-O-β-D-呋喃芹糖基-（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖苷及丹酚酸B的含量為考察指標，進行水提工藝最佳參數的確定［1］。提取工藝因素水平設計見表1。稱取4劑處方量的合歡皮、丹參等9味藥材共9份，按相應的因素水平進行水煎，水煎液濃縮成約250mL，備用。

表1 提取工藝因素水平設計

2.2 供試品溶液的制備取約相當于0.5g合歡皮藥材的濃縮液5mL，精密量取，置錐形瓶中，精密加入甲醇10mL、水5mL，使溶液甲醇濃度為50%，稱定重量，超聲30min，放冷，再稱定重量，用50%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.3 HPLC測定（-）-丁香樹脂酚-4-O-β-D-呋喃芹糖基-（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖苷含量

2.3.1 色譜條件色譜柱：Diamonsil C18（2）5u柱（250mm× 4.6mm，225-1125）；流動相為甲醇：水梯度洗脫，0～30min（18∶82），35～40min（100∶0），45～50min（18∶82）；檢測波長：204nm；流速：1.0mL/min；柱溫：30℃。

2.3.2 對照品溶液制備及線性關系考察精密稱取于五氧化二磷減壓干燥器中干燥24h的（-）-丁香樹脂酚-4-O-β-D-呋喃芹糖基-（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖苷對照品適量，加甲醇制成1mg/mL的溶液，作為對照品儲備溶液。精密吸取1mg/mL（-）-丁香樹脂酚-4-O-β-D-呋喃芹糖基-（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖苷對照品溶液0.125、0.25、0.75、1.25、1.75、2.5mL分別置于25mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，使濃度分別為0.005、0.01、0.03、0.05、0.07、0.1mg/mL。分別吸取上述各對照品溶液20μL，進樣，按上述色譜條件測定峰面積值，以峰面積均值（Y）為縱坐標，進樣濃度（X）為橫坐標，繪制標準曲線，得回歸方程Y=59.12.83X+ 9.68，r=0.9989。結果表明（-）-丁香樹脂酚-4-O-β-D-呋喃芹糖基-（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖苷進樣量在0.1～2μg范圍內呈良好的線性。

2.3.3 樣品中（-）-丁香樹脂酚-4-O-β-D-呋喃芹糖基-（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖苷的含量測定分別精密吸取對照品溶液（濃度為0.01、0.05mg/mL）及各供試品溶液20μL注入液相色譜儀，每個樣品平行進樣2次，以外標兩點法計算，測定各樣品中（-）-丁香樹脂酚-4-O-β-D-呋喃芹糖基-（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖苷的含量。結果見表2、表3。

2.4 HPLC法測定丹酚酸B含量

2.4.1 色譜條件以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動相為乙腈：2%乙酸溶液梯度洗脫，0～5min（17∶83）；19～26min（27∶73）；流速：1.0mL/min；檢測波長：284nm；柱溫：30℃；進樣量：10μL；理論板數按丹酚酸B峰計算不低于2000。

表2 正交試驗結果

表3 （-）-丁香樹脂酚-4-O-β-D-呋喃芹糖基-（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖苷方差分析

2.4.2 對照品溶液及線性關系考察精密稱取經五氧化二磷減壓干燥器中干燥24h的丹酚酸B對照品適量，加甲醇制成每1mg/mL的溶液，作為對照品儲備溶液。精密吸取1mg/mL的丹酚酸B儲備液0.1、0.5、1、2、3、5mL，用50%甲醇定容至10mL的容量瓶中，搖勻，分別得到濃度為0.01、0.05、0.1、0.2、0.3、0.5mg/mL的丹酚酸B系列對照品溶液。分別吸取上述各對照品溶液10μL，進樣，按上述色譜條件測定峰面積值，以峰面積均值（Y）為縱坐標，進樣濃度（X）為橫坐標，繪制標準曲線。得回歸方程Y= 11784.73X－58.80，r=0.9999（n=6）。結果表明丹酚酸B進樣量在0.1～5μg范圍內呈良好的線性。

2.4.3 樣品中丹酚酸B的含量測定分別精密吸取對照品溶液（濃度為0.1mg/mL，0.5mg/mL）及各供試品溶液10μL注入液相色譜儀，每個樣品平行進樣2次，以外標兩點法計算，測定各樣品中丹酚酸B的含量。結果見表2、表4。

表4 丹酚酸B方差分析

綜合（-）-丁香樹脂酚-4-O-β-D-呋喃芹糖基-（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖苷、丹酚酸B含量的方差分析結果，同時結合生產實際中降低成本、節約時間等因素，最終確定最優工藝條件為A1B2C3D2。即加飲片總量25倍量水分3次提取，每次1.5h。

2.5 最佳工藝驗證取4劑處方量的合歡皮、丹參等9味藥材各3份，按最佳水提工藝進行提取，即藥材不浸泡，加飲片總量25倍量的水，分3次煎煮，每次1.5h。合并水煎液，濃縮至250mL，取樣測定水煎液中（-）-丁香樹脂酚-4-O-β-D-呋喃芹糖基-（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖苷及丹酚酸B的含量，色譜條件和供試品溶液的制備方法與水提正交樣品相同。結果見表5。結果可見，3次試驗所測得的（-）-丁香樹脂酚-4-O-β-D-呋喃芹糖基-（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖苷及丹酚酸B的含量與最佳工藝所測得的平均含量比較相近，說明該工藝穩定、可行。

3 討論

實驗過程中，飲片的品種繁多，質量差異很大，而且有的飲片中含有的有效成分很低，不能達到制劑的要求，因此在投料前必須控制飲片的質量。

（-）-丁香樹脂酚-4-O-β-D-呋喃芹糖基-（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖苷的含量測定參照2010版《中國藥典》一部合歡皮項下（-）-丁香樹脂酚-4-O-β-D-呋喃芹糖基-（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖苷的含量測定方法。實驗曾比較了文獻中合歡皮的含量測定方法，流動相為甲醇∶水（34∶66）［2］，但峰形不好，干擾多，故最終確定2010版《中國藥典》一部合歡皮項下含量測定方法。因該方藥味多，60多分鐘仍有峰出現，故最終確定的流動相為梯度洗脫。

丹酚酸B的含量測定參照2010版《中國藥典》一部丹參項下丹酚酸B的含量測定方法。實驗曾比較了文獻中丹參的含量測定方法，流動相為甲醇-乙腈-甲酸-水（30∶10∶1∶59），流動相復雜，因本試驗所用高效液相色譜儀為二元泵，需要人工將流動相進行混合，增加了誤差，經查閱了大量的文獻和反復摸索，故最終確定丹參的流動相為上述梯度洗脫方法。

本實驗采用正交試驗法優選歡天安神飲水提工藝，以（-）-丁香樹脂酚-4-O-β-D-呋喃芹糖基-（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖苷和丹酚酸B含量為指標，采用HPLC法進行含量測定，結果進行方差分析，最終優選出A2B2C3D2的制備工藝，又通過最佳水提工藝驗證實驗也證明了該工藝的合理性。

［1］張建玲，賀祝英，吳紅梅.正交試驗優選心衰寧合劑水提工藝.中國實驗方劑學雜志，2011，17（7）：30

［2］干國平，朱紅，師磊，等.不同產地山合歡皮中（-）-丁香樹脂酚-4-O-B-D-葡萄糖苷含量的比較.藥物分析雜志，2009，29（4）：606

編輯：吳寧

表5 水提工藝驗證結果

R289.5

A

1672-397X（2015）11-0056-03歡天安神飲為臨床上使用多年的安全、有效方，主要由合歡皮、景天三七、丹參、酸棗仁等9味中藥組成，具有解郁安神、活血消腫的功效。因方中君藥為合歡皮，其有效成分為水溶性成分，且臨床應用劑型為湯劑，故本實驗選用水提工藝進行研究，以浸泡時間、加水量、提取次數、提取時間等工藝條件為考察因素，以（-）-丁香樹脂酚-4-O-β-D-呋喃芹糖基-（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖苷、丹酚酸B的含量為考察指標，進行提取工藝的優化研究。

郭華（1976—），女，本科學歷，主管中藥師，中藥學專業。

李文，本科學歷，主任中藥師。510531043@qq.com

2015-05-26