利拉魯肽對2型糖尿病阿爾茨海默病樣三重轉基因小鼠學習記憶的影響

孫潔，陳書儀，路素素，鄭軍，鄧艷秋

實驗研究

利拉魯肽對2型糖尿病阿爾茨海默病樣三重轉基因小鼠學習記憶的影響

孫潔，陳書儀，路素素，鄭軍，鄧艷秋△

目的研究2型糖尿病（T2DM）對阿爾茨海默病（AD）樣APP/PS1/Tau三重轉基因（3×Tg）小鼠學習記憶能力的影響和利拉魯肽（LIR）對此模型神經保護作用的相關機制。方法將1月齡C57BL/6小鼠設為正常對照（WT）組，1月齡3×Tg小鼠分為對照（Tg）組、單純利拉魯肽（Tg+LIR）組、Tg+T2DM組、T2DM+利拉魯肽（Tg+T2DM+LIR）組。T2DM造模方法為喂2個月高脂高糖飼料，然后腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ），空腹血糖大于7 mmol/L為造模成功，腹腔注射LIR治療2個月。5月齡時測體質量、空腹血糖。Morris水迷宮檢測空間學習記憶能力，Western blot?ting檢測Tau、神經絲（NFs）和胰島素受體底物（IRS）磷酸化水平。ELISA檢測轉入的人APP基因表達的人β淀粉樣蛋白（Aβ）42，檢測LIR對Aβ的影響。結果與Tg組比較，Tg+T2DM組小鼠質量、空腹血糖、逃避潛伏期、pT231、pT181、SMI31、Aβ42增加，穿越隱匿平臺次數及pIRS減少。LIR能減輕高脂高糖飲食及T2DM造成的體質量和血糖的增加，能緩解T2DM對3×Tg小鼠空間學習記憶能力的損傷，改善T2DM對3×Tg小鼠Tau、NFs及IRS蛋白磷酸化的影響，減少3×Tg小鼠的Aβ沉積。結論T2DM會加重3×Tg小鼠的AD樣癥狀，而LIR對其有保護作用。

阿爾茨海默病；糖尿病，2型；淀粉樣β蛋白；胰島素抵抗；利拉魯肽；Tau；胰島素受體底物；神經絲

阿爾茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是以學習記憶和認知功能進行性減退為主要特征的神經退行性疾病，其顯著病理學特征是主要成分為β-淀粉樣蛋白（β-amyloid，Aβ）的老年斑、異常過度磷酸化的微管相關蛋白Tau和骨架蛋白神經絲（neurofila?ments，NFs）組成的神經原纖維纏結。2型糖尿病（T2DM）與AD有密切關聯，胰島素信號通路相關蛋白功能障礙可能是T2DM和AD的共同發病基礎［1］。流行病學調查顯示T2DM導致AD的患病風險增加了約2～5倍［2-4］。輕度認知功能障礙及AD患者正電子發射型計算機斷層顯像（PET-CT）結果顯示局部腦區糖代謝減少［5］。腦內糖代謝紊亂及Aβ的神經毒性可能是AD主要初始病因［6-7］。近年來，胰高血糖素樣肽-1（GLP-1）類似物利拉魯肽（Liraglu?tide，LIR）對神經系統的保護作用得到證實［8］。本研究在AD樣三重轉基因（3×Tg）小鼠的基礎上建立T2DM模型，旨在探討T2DM對AD樣小鼠的影響及利拉魯肽對神經系統保護作用的相關機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物與分組清潔級野生C57BL/6小鼠8只（購自中國醫學科學院放射醫學研究所），APP/PS1/Tau三重轉基因小鼠32只（購自美國MRRC實驗室），鼠齡1月齡，體質量10～14 g，野生組為正常對照（WT）組，三重轉基因組按隨機數字表法分為對照（Tg）組、單純利拉魯肽（Tg+LIR）組、T2DM模型（Tg+T2DM）組、T2DM+利拉魯肽治療（Tg+T2DM+LIR）組，每組8只，按標準實驗動物飼養。

1.1.2主要儀器與試劑高脂高糖飼料成分為10%豬油、20%蔗糖、10%蛋黃粉、1%膽固醇、0.2%膽鹽和普通飼料成分；鏈脲佐菌素（STZ）購于Sigma公司；利拉魯肽購于諾和諾德制藥有限公司；Tau5抗體、Tau［pT231］抗體、人β淀粉樣蛋白42（human Aβ42）酶聯免疫吸附檢測（ELISA）試劑盒均購于美國Invitrogen公司；P-IRS抗體和Tau［pT181］抗體購于Cell Signaling Technologies；SMI31抗體購于美國Sternberger公司；辣根過氧化物酶標記的羊抗小鼠抗體和羊抗兔抗體購于英國Abcam公司。β-actin抗體和ECL化學發光試劑盒購于中國碧云天生物技術研究所。

1.2方法

1.2.1造模和給藥T2DM模型為從1月齡開始喂高脂高糖飼料2個月，3月齡時腹腔注射1次小劑量STZ，STZ用0.1 mol/L檸檬酸緩沖液（pH 4.2）配成濃度為1%的溶液，注射劑量為150 mg/kg，注射前小鼠禁食16 h。對照組喂普通飼料，注射等劑量生理鹽水。從注射STZ后第3天測空腹血糖，高于7 mmol/L為造模成功，可開始腹腔注射利拉魯肽治療，劑量為300 μg/kg，持續治療2個月，每天上午注射1次，其他組用等劑量生理鹽水，在小鼠5月齡時開始檢測各指標。

1.2.2空腹血糖檢測小鼠治療2個月后，禁食10 h，尾靜脈采血，使用強生血糖儀測量。

1.2.3Morris水迷宮實驗在治療第55天開始連續6 d的水迷宮實驗。前5 d定位航行實驗：將小鼠面朝池壁分別由4個入水點依次放入水中，記錄小鼠從入水到找到隱藏在水下的平臺的逃避潛伏期。第6天撤掉平臺進行空間探索實驗：將小鼠從4個入水點依次放入水中，記錄小鼠在60 s內穿越之前隱匿平臺位置的次數。

1.2.4Western blotting小鼠處死后快速取腦，-80℃保存。用PIPA裂解液（含PMSF，cocktail蛋白酶抑制劑）勻漿，然后用BCA蛋白定量法測量，酶標儀562 nm測量蛋白濃度，通過不同濃度蛋白標準品計算出公式，然后計算出各組樣品蛋白濃度，再加入不同體積的上樣緩沖液和水，使各組蛋白等量。SDS-PAGE電泳，再用PVDF膜濕轉，5%BSA封閉后，一抗4℃過夜，二抗室溫1.5 h，ECL發光、顯影、定影。Im?age J軟件分析各檢測結果，用Tau5和β-actin做內參。Tau［pT231］抗體和Tau［pT181］檢測Tau蛋白在231和181位點的磷酸化水平，以Tau5做內參；P-IRS抗體檢測胰島素受體底物（insulin receptor substrate，IRS）磷酸化水平，SMI31抗體檢測NFs重鏈和中鏈的磷酸化水平，均以β-actin做內參。

1.2.5ELISA按human Aβ42 ELISA試劑盒說明書逐步操作，主要步驟包括加入標準品和樣品（小鼠腦組織），加入抗體，沖洗，加緩沖液和終止液，450 nm酶標儀檢測腦組織中Aβ42的含量。

1.3統計學方法采用SPSS 17.0統計軟件分析，數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，多重比較方差齊用LSD-t法，方差不齊用Tamhane′s T2法，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1體質量及空腹血糖結果在5月齡時，WT組、Tg組、Tg+LIR組的體質量、空腹血糖比較差異均無統計學意義。而Tg+T2DM組體質量和空腹血糖較Tg組增加（P＜0.05），Tg+T2DM+LIR組治療后體質量和空腹血糖較Tg+T2DM組降低（P＜0.05），見表1。

Tab.1Comparison of body weight and fasting blood glucose between five groups of mice表1 小鼠體質量和空腹血糖比較（n=8，）

Tab.1Comparison of body weight and fasting blood glucose between five groups of mice表1 小鼠體質量和空腹血糖比較（n=8，）

＊P＜0.05；a與Tg組比較，b與WT組比較，c與Tg+T2DM組比較，P＜0.05；表2～4同

組別WT組Tg組Tg+LIR組Tg+T2DM組Tg+T2DM+LIR組F體質量（g）27.63±2.30 28.65±2.28 28.48±2.30 34.91±3.00ab31.84±2.11c12.580＊空腹血糖（mmol/L）4.85±0.64 5.13±0.86 4.84±0.71 10.74±1.88ab7.73±1.50c35.913＊

2.2Morris水迷宮結果

2.2.1定位航行實驗逃避潛伏期比較顯示，5月齡的Tg組、Tg+LIR組、WT組差異無統計學意義。訓練第2天Tg+T2DM組逃避潛伏期較Tg組增加（P＜0.05），Tg+T2DM組與WT組比較差異無統計學意義。但從訓練第3天開始，Tg+T2DM組逃避潛伏期較WT組和Tg組均增加（P＜0.05），其尋找平臺的方式中邊緣式和隨機式增多。Tg+T2DM+LIR組治療后與Tg+T2DM組相比逃避潛伏期減少（P＜0.05），見表2。

Tab.2Comparison of mean escape latency in place navigation test between five groups of mice表2 小鼠定位航行平均逃避潛伏期的比較（n=8，s，）

Tab.2Comparison of mean escape latency in place navigation test between five groups of mice表2 小鼠定位航行平均逃避潛伏期的比較（n=8，s，）

組別WT組Tg組Tg+LIR組Tg+T2DM組Tg+T2DM+LIR組F第1天43.97±12.06 41.00±11.68 41.56±13.08 44.53±12.51 40.06±10.29 0.209第2天32.19±9.33 24.50±4.30 34.69±11.61 40.78±7.96a 34.44±10.48 3.334＊組別WT組Tg組Tg+LIR組Tg+T2DM組Tg+T2DM+LIR組F第3天23.00±7.37 19.44±7.61 22.75±9.08 33.09±11.26ab 23.44±8.80c 2.651＊第4天19.28±5.46 18.28±6.22 16.81±5.54 27.09±3.20ab 20.60±3.77c 5.133＊第5天14.34±3.53 15.13±5.10 14.72±4.33 20.25±6.49ab 12.97±4.16c 2.663＊

2.2.2空間探索實驗WT組、Tg組、Tg+LIR組穿越隱匿平臺次數差異無統計學意義，而Tg+T2DM組較Tg組減少（P＜0.05），Tg+T2DM+LIR組治療后較Tg+T2DM組增多（P＜0.05），見表3。

Tab.3Comparison of the number of crossing hidden platform and levels of human Aβ42 in brain tissue between five groups of mice表3 小鼠穿越隱匿平臺次數和腦組織中的human Aβ42水平的比較（n=8，）

Tab.3Comparison of the number of crossing hidden platform and levels of human Aβ42 in brain tissue between five groups of mice表3 小鼠穿越隱匿平臺次數和腦組織中的human Aβ42水平的比較（n=8，）

組別WT組Tg組Tg+LIR組Tg+T2DM組Tg+T2DM+LIR組F穿越隱匿平臺次數4.16±0.53 4.22±0.66 4.03±0.97 3.03±0.51ab4.13±0.61c4.319＊Aβ42（ng/g）-30.76±1.48 22.17±2.27a37.38±1.83a31.80±2.17c32.500＊

2.3Western blotting結果5月齡的Tg組與WT組pT231、pT181、SMI31及pIRS的表達差異無統計學意義，Tg+T2DM組pT231、pT181和SMI31表達較Tg組和WT組增多，Tg+T2DM+LIR組治療后較Tg+ T2DM組減少（均P＜0.05）。Tg+T2DM組pIRS表達較Tg組和WT組降低，Tg+T2DM+LIR組治療后較Tg+T2DM組增高（均P＜0.05），見圖1，表4。

Fig.1The expression levels of phosphorylated Tau，NF-HM and IRS圖1 Tau、神經絲重鏈和中鏈、IRS的磷酸化水平的表達

Tab.4Comparison of phosphorylated Tau，NFs and IRS between five groups of mice表4 Tau、NFs和IRS磷酸化水平的比較（n=3，）

Tab.4Comparison of phosphorylated Tau，NFs and IRS between five groups of mice表4 Tau、NFs和IRS磷酸化水平的比較（n=3，）

組別WT組Tg組Tg+T2DM組Tg+T2DM+LIR組F pT231 0.58±0.04 0.57±0.08 0.97±0.02ab 0.71±0.07c 32.993＊pT181 0.40±0.02 0.39±0.08 0.94±0.02ab 0.74±0.03c 118.772＊SMI31 0.53±0.03 0.67±0.07 0.96±0.03ab 0.73±0.06c 43.370＊pIRS 0.72±0.06 0.72±0.08 0.36±0.03ab 0.50±0.02c 35.921＊

2.4ELISA結果野生型小鼠不存在人APP基因，未檢測到human Aβ42。Tg+LIR組Aβ42較Tg組減少，Tg+T2DM組較Tg組增多，Tg+T2DM+LIR組較Tg+T2DM組減少（均P＜0.05），見表3。

3 討論

中樞神經系統胰島素信號傳導系統正常才能維持顱內血液及能量代謝正常［9］，長時間的高血糖狀態及胰島素抵抗狀態會增加輕度認知功能障礙的患病率，增加神經退行性疾病的患病風險［10］。胰島素信號傳導系統與腦內葡萄糖代謝和能量產生、細胞內外Aβ的聚集、Tau和NFs過度磷酸化、神經元及神經祖細胞凋亡、氧化應激及壞死有關［11-12］。而且，Aβ寡聚體會和胰島素競爭結合胰島素受體，使其磷酸化降低，影響其正常信號傳導功能［1］。

3×Tg小鼠3個月時可在皮質區的細胞內檢測到Aβ，6個月時可在皮質區細胞外和海馬CA1區檢測到，且6個月開始出現認知功能障礙，磷酸化的Tau蛋白逐漸增多，且一直是伴隨在Aβ之后出現，其病理進程與人類AD相似，是目前研究此類疾病的最佳動物模型［13］。本研究顯示：Tg組5月齡3×Tg小鼠在水迷宮實驗中的逃避潛伏期和穿越隱匿平臺次數與野生小鼠沒有顯著差異，而Tg+T2DM組患有T2DM的3×Tg小鼠在5月齡時即與野生小鼠有差異，說明T2DM會加速AD的病理進程，而利拉魯肽能延緩T2DM對AD的影響，對小鼠的空間記憶能力有保護作用。Western blotting檢測結果說明5月齡Tg組和WT組小鼠的Tau、NFs和IRS蛋白的磷酸化水平的差異不大，但T2DM能增高5月齡3×Tg小鼠的Tau和NFs蛋白的磷酸化水平，降低IRS磷酸化水平，利拉魯肽治療后可緩解T2DM對轉基因小鼠Tau、NFs及IRS蛋白的磷酸化水平的影響。ELISA結果顯示利拉魯肽可降低轉基因小鼠的Aβ的沉積，亦可緩解T2DM加速轉基因小鼠Aβ沉積而造成的不良影響。本實驗結果顯示利拉魯肽可能通過調節IRS磷酸化水平來改善胰島素信號傳導系統，調節腦內糖代謝，進一步影響Tau和NFs蛋白的表達量，且可以通過降低Aβ的沉積而降低其神經毒性，表明利拉魯肽可能會成為治療目前認為是腦內糖代謝紊亂及Aβ神經毒性為主要初始AD病因的有效藥物。

臨床上，T2DM患者可能會出現認知功能障礙等癥狀，然而AD患者也可能會出現高血糖、高膽固醇血癥及胰島素抵抗等癥狀；動物實驗表明T2DM與AD模型在行為、認知和血管形態等方面存在相似處，提示這兩種疾病之間可能互為因果［14］。T2DM和AD有很多相似的病理特征和生理功能上的改變，例如T2DM和AD都有淀粉樣蛋白的沉積，都有細胞骨架蛋白的異常磷酸化，都有胰島素信號傳導的異常。有實驗研究顯示胰島素可以改善AD樣小鼠學習記憶能力［15］，因此，利用GLP-1改善AD患者胰島素信號通路是一個很重要的治療環節。GLP-1可通過血腦屏障在相應腦區與GLP-1R結合而發揮作用。人工合成的GLP-1類似物利拉魯肽抵抗二肽基肽酶Ⅳ（DPP-Ⅳ）降解的能力增強，血清半衰期可達12～24 h。GLP-1的神經保護作用也得到證實，如GLP-1R基因敲除的小鼠的學習記憶出現損傷，GLP-1類似物能減輕APP/PS1小鼠突觸的丟失，保護突觸可塑性，減輕腦內Aβ的沉積和炎癥反應，促進齒狀回神經前體細胞的增殖［8，16-17］。

綜上所述，GLP-1類似物可改善轉基因小鼠學習記憶能力及腦組織的神經退行性變，其機制可能與改善胰島素信號通路，降低Aβ有關，但其更廣泛的作用機制及具體的信號通路還不明確，尚待進一步的研究。

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（2015-01-21收稿 2015-03-23修回）

（本文編輯 李國琪）

The effects of liraglutide on learning and memory in Alzheimer-like triple transgenic mice with type 2 diabetes

SUN Jie，CHEN Shuyi，LU Susu，ZHENG Jun，DENG Yanqiu△
Department of Physiology and Pathophysiology，School of Basic Medical Science，Tianjin Medical University，Tianjin 300070，China△

ObjectiveTo investigate the effects of type 2 diabetes on learning and memory of APP/PS1/Tau triple transgenic（3×Tg）mice of Alzheimer’s disease，and the protective mechanism of liraglutide（LIR）thereof.MethodsOne month old C57BL/6 mice were set to be control group（WT）.One month old 3×Tg mice were divided into control group（Tg），liraglutide group（Tg+LIR），type 2 diabetes group（Tg+T2DM）and liraglutide treatment group（Tg+T2DM+LIR）.The model of T2DM was established by feeding the high fat and sugar fodder，and then injecting streptozotocin（STZ）in mice，making sure the fasting blood glucose was more than 7 mmol/L.Then the subcutaneous injection of LIR was administered for 2 months.The values of body weight and fasting blood glucose were detected at age of 5-month.Morris water maze was applied to evaluate the spatial learning and memory ability.Western blotting assay was used to measure the levels of phosphorylated Tau，neurofilament（NFs）and insulin receptor substrates.ELISA was used to detect the human Aβ 42 to evaluate the effect of LIR on-amyloid.ResultsLIR can reduce body weight and blood glucose，can alleviate spatial learning and memory damaging caused by T2DM，and also can improve phosphorylated Tau levels，NFs and insulin receptor substrates caused by T2DM，and finally can reduce the deposition of β-amyloid of 3×Tg mice.ConclusionT2DM can aggravate symptoms of AD in 3×Tg mice，and LIR has a protective effect on it.

Alzheimer disease；diabetes mellitus，type 2；amyloid beta-protein；insulin resistance；liraglutide；Tau；insulin receptor substrate；neurofilaments

R742

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.07.007

國家自然科學基金資助項目（81270422）

天津醫科大學基礎醫學院生理學與病理生理學教研室（郵編300070）

孫潔（1988），女，碩士在讀，主要從事神經退行性變研究

△通訊作者E-mail:dengyanqiu66@gmail.com