中央內側丘腦核中NMDA受體參與丙泊酚致意識消失的作用

張益，羅竺欣，王袁，段自坤，李佳

中央內側丘腦核中NMDA受體參與丙泊酚致意識消失的作用

張益1，2，羅竺欣2，王袁2，段自坤2，李佳2

目的探討中央內側丘腦核（CMT）中N-甲基-D-天門冬氨酸（NMDA）受體在全身麻醉意識消失中的作用。方法60只大鼠微注射模型隨機均分為4組：NMDA10 mmol/L組、NMDA20 mmol/L組、NMDA40 mmol/L組及對照組（C組），丙泊酚麻醉后分別于前3組CMT內微量泵注10、20和40 mmol/L的NMDA以及等體積生理鹽水（C組）。觀察微注射后自主體動反應的發生率以及翻正反射恢復時間，并通過組織學對微注射位點進行定位。結果當注射位點在CMT中時，與C組相比，各濃度NMDA組大鼠麻醉后翻正反射恢復時間均明顯縮短；其中NMDA20 mmol/L與40 mmol/L組恢復時間短于NMDA10 mmol/L組，且NMDA20 mmol/L與40 mmol/L組大鼠麻醉中自主體動的發生率顯著高于C組（均P＜0.05）。當注射部位在CMT外時，各濃度NMDA組翻正反射恢復時間均明顯長于注射部位在CMT內者（P＜0.05），而各組間比較自主體動發生率與翻正反射恢復時間均無明顯差異（P＞0.05）。結論CMT中的NMDA受體參與了丙泊酚所導致的全身麻醉效應。

麻醉藥，全身；丘腦中央核；受體；N-甲基-D-天冬氨酸；二異丙酚；中央內側丘腦；NMDA受體；意識消失；腦區微注射

丘腦皮質環路在睡眠與覺醒過程中發揮著至關重要的作用，其中的中線核群、板內核群等均屬于非特異性的覺醒系統［1］。板內核群中的中央內側丘腦核（central medial thalamus，CMT）含有多種神經遞質受體，接受來自皮質下的多條投射，并發出纖維投射至廣泛的皮質和皮質下腦區，是全身麻醉藥作用的關鍵區域之一［2］。然而，對于CMT中哪種受體在全身麻醉導致意識消失的過程中發揮主要作用，目前尚無定論。谷氨酸（glutamate，Glu）是中央神經系統中重要的興奮性神經遞質，Glu受體是其作用靶點。在眾多Glu受體中，以N-甲基-D-天門冬氨酸（N-methyl-D-aspartale，NMDA）受體與全身麻醉的關系最為緊密［3］。腦內NMDA受體分布廣泛，在神經系統的發育以及功能維持中均發揮著關鍵的作用［4］。CMT中也含有大量NMDA受體，但其是否參與了全麻藥致意識消失的作用，目前鮮見相關報道。本研究于CMT內注射特異性NMDA受體激動劑，觀察其對丙泊酚全身麻醉作用的影響，探討CMT中NMDA受體在全麻藥導致意識消失中的作用。

1 材料與方法

1.1實驗動物及分組健康成年雄性SPF級SD大鼠60只，250～350 g，購自第三軍醫大學實驗動物中心，動物許可證號：SCXK（渝）2007-0005。常規飼養1周后開始實驗，12 h白天/夜晚輪換人工光照，自由飲水、進食。按隨機數字表法隨機分為生理鹽水對照組（C組）、NMDA10 mmol/L組、NMDA20 mmol/L組和NMDA40 mmol/L組，每組15只。

1.2主要試劑丙泊酚（阿斯利康公司，1%，國藥準字H20030427）；NMDA（SIGMA公司，美國）。

1.3方法

1.3.1動物模型建立參考文獻［5］中的方法建立標準CMT微注射模型，戊巴比妥50 mg/kg腹腔注射麻醉后，將大鼠頭部固定于腦立體定位儀上（Stoelting公司，美國），1%利多卡因皮下注射后切開頭皮，分離組織暴露顱骨，按腦立體定位圖譜確定CMT的位置，坐標為：前囟后3.1 mm，中線旁開1.7 mm并傾斜13°，深度4.5 mm。用顱骨鉆鉆開頭骨，按坐標放置微注射套管至距中央丘腦0.2 mm處，并用牙科水泥固定。術后恢復1周開始正式實驗。

1.3.2腦區微注射各組大鼠均放入透明實驗箱內，以2%異氟醚麻醉，翻正反射消失后用24號靜脈留置針置入大鼠尾靜脈，取出大鼠頭部套管管芯，將一根比套管長0.2 mm的注射針插入套管，另一端以延長管連接微量注射泵（RWD202，深圳瑞沃德公司）。然后停止異氟醚麻醉，吸入空氣。待大鼠自主活動恢復后20 min，于尾靜脈單次注射10 mg/kg丙泊酚，待翻正反射消失后1 min開始腦區微注射。NMDA10 mmol/L組、NMDA20 mmol/L組和NMDA40 mmol/L組分別泵入0.5 μL濃度為10、20、40 mmol/L的NMDA，C組泵入相同體積的生理鹽水，泵注時間1 min。記錄腦區微注射后短時間內自主體動的發生率和翻正反射完全恢復的時間。

1.3.3組織染色定位實驗結束后，通過微注射導管，將0.1 μL 2%滂胺天藍溶液以0.2 μL/min速率緩慢注入CMT中，留針2 min，使溶液完全被吸收。用剪刀剪開大鼠胸腔，充分暴露心臟，將灌流針從心尖插入主動脈，同時剪開右心耳，快速注入200 mL生理鹽水，再緩慢注入4%多聚甲醛300 mL，持續2～3 h。隨后斷頭，迅速取出腦組織，將標本放入10%福爾馬林溶液中固定48 h后，浸泡于4℃20%蔗糖溶液中脫水直至沉底。截取含微注射進針處的腦組織，行冠狀冰凍切片，厚25 μm，收集注射部位附近的切片進行中性紅染色、制片，于光學顯微鏡下觀察。

1.4統計學方法統計學分析采用SPSS 19.0軟件，計量資料以表示，組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用LSD-t法，相同濃度組內比較采用t檢驗，計數資料比較行Fisher確切概率法；P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1組織學定位結果C組、NMDA10 mmol/L組、NMDA20 mmol/L組、NMDA40 mmol/L組微注射部位在CMT范圍內的例數分別為：10（66.7%）、7（46.7%）、11（73.3%）和9（60.0%）例。15例發生自主體動，其中14例的微注射點位于CMT內，1例位于CMT外，見圖1。

Fig.1Histological localizations of NMDA microinfusion tips圖1 NMDA注射位點的組織學定位結果

2.2腦區微注射后自主體動反應的發生率與C組相比，CMT內微注射20、40 mmol/L NMDA可導致大鼠發生明顯的自主體動反應（P＜0.05）；當藥物注射于CMT外時，各濃度NMDA組的自主體動發生率與C組差異無統計學意義（P＞0.05）。相同濃度組內微注射部位在CMT范圍內和CMT范圍外的自主體動發生率差異均無統計學意義，見表1。

2.3大鼠翻正反射恢復時間比較與C組相比，在CMT內注射NMDA后大鼠翻正反射恢復時間明顯縮短（P＜0.05），NMDA 20 mmol/L組與NMDA 40 mmol/L組的翻正反射恢復時間少于NMDA 10 mmol/L組，但NMDA 20 mmol/L組與NMDA 40 mmol/L組間差異無統計學意義（P＞0.05）；當NMDA注射在CMT外時，各組間的翻正反射恢復時間差異無統計學意義（P＞0.05）。相同濃度組內比較：除C組外，各濃度NMDA組注射于CMT內的翻正反射恢復時間均短于注射于CMT外者（P＜0.05），見表1。

Tab.1The response time and recovery time after microinfusion in six groups表1 各組微注射后反應及翻正反射恢復時間

3 討論

CMT屬于丘腦非特異性投射系統，是中腦網狀結構的延伸，在維持覺醒和全身麻醉的過程中均發揮著重要的作用［3，6］。研究顯示，CMT中的N型乙酰膽堿受體［7］和Kv1家族鉀通道［5］不同程度地參與了全身麻醉導致意識消失的過程。而關于CMT中NMDA受體與全身麻醉的關系，目前鮮見報道。從中腦網狀結構至CMT的投射主要為谷氨酸能系統，丙泊酚可對NMDA受體激活后的電流產生可逆性的抑制，而對NMDA受體親和力無明顯影響［8］；因此，在CMT中注射NMDA可在局部激活NMDA受體，逆轉丙泊酚的抑制作用，從而維持覺醒系統的部分功能，而正是這部分功能在本實驗中導致大鼠從全身麻醉中產生行為覺醒和自主運動。這一結果說明CMT中的NMDA受體至少參與了丙泊酚麻醉所導致的鎮靜和制動兩個方面的麻醉效果。本研究結果還提示，20 mmol/L和40 mmol/L的NMDA對丙泊酚麻醉的催醒作用顯著強于10 mmol/L的NMDA，說明其逆轉效應具有一定的濃度依賴性。然而，NMDA 20 mmol/L和40 mmol/L兩個濃度所產生的效應卻沒有明顯差別，這主要是由于在20～40 mmol/L的濃度區間微注射范圍內CMT的NMDA受體已經飽和，增加NMDA的量不會再引起效應的增強。

另一方面，NMDA的注射部位與其作用之間存在著密切的關系。本研究中15例發生自主體動大鼠的微注射位點有14例位于CMT內，而NMDA注射部位在CMT外時，大鼠發生自主體動的例數減少（差異無統計學意義可能主要是由于樣本量少所致），同時對翻正反射恢復時間的縮短作用消失，進一步說明了CMT在全身麻醉作用中發揮效應部位的特異性。

綜上所述，CMT中NMDA受體參與了丙泊酚所導致的全身麻醉效應。

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（2015-02-02收稿 2015-03-10修回）

（本文編輯 閆娟）

NMDA receptors in central medial thalamus participate in propofol-induced unconsciousness

ZHANG Yi1，2，LUO Zhuxin2，WANG Yuan2，DUAN Zikun2，LI Jia2
1 Department of Anesthesiology，Affiliated Hospital of Zunyi Medical University，Guizhou 563000，China；2 Guizhou Key Laboratory of Anesthesia and Organ Protection，Zunyi Medical University

ObjectiveTo investigate the role of NMDA receptors in central medial thalamus（CMT）in the unconscious?ness induced by general anesthesia.MethodsA total of 60 rat models for microinfusion were assigned into 4 groups（n=15 for each group）.After induction with propofol，10 mmol/L（NMDA10 group），20 mmol/L（NMDA 20 group）and 40 mmol/L（NMDA40 group）of NMDA and normal saline（group C）with equal volume were microinfused into CMT.The incidence of purposeful movement and recovery time of righting reflex were observed in each group respectively.Infusion sites were local?ized by histological method.ResultsWhen the microinfusion site localized within CMT，comparing with group C，the recov?ery time of righting reflex reduced notably in three NMDA groups（P＜0.05）.The recovery time was significantly shorter in NMDA20 group and NMDA40 group than that of NMDA10 group.The incidence of purposeful movement during propofol an?esthesia was higher in NMDA20 group and NMDA40 group than that of group C（P＜0.05）.When the microinfusion site lo?calized out of CMT，the recovery time of righting reflex was remarkably longer than that within CMT in three NMDA groups（P＜0.05），and there was no significant difference in the incidence of purposeful movement and recovery time between four group（P＞0.05）.ConclusionMicroinfusion of NMDA agonist into CMT reverses propofol anesthesia，indicating that NMDA receptor in CMT may contribute to the propofol-induced unconsciousness.

anesthetics，general；midline thalamic nuclei；receptors；N-methyl-D-aspartate；propofol；central thala?mus；NMDA receptor；loss of consciousness；intracranial microinjection

R614.2

A

10.11958/j.issn.0253-9896.2015.07.010

貴州省教育廳項目（黔科合J字LKZ［2011］06號）

1貴州省遵義醫學院附屬醫院麻醉科（郵編563000）；2遵義醫學院麻醉與器官保護基礎研究重點實驗室

張益（1983），男，主治醫師，博士在讀，主要從事全身麻醉機制研究