非編碼RNA在鼻咽癌中的表達研究

陳明政 鄒學森 李金高 龔小昌 敖 帆 陳文學

從基因組研究數據發現高等動物及人類基因組中編碼蛋白質的區域只占1%～2%，大多數區域不編碼蛋白質，但是會通過轉錄產生大量的非編碼 RNA(noncoding RNA，ncRNA)，這些ncRNA沒有開放性讀碼框，或者有一個保守性非常差的短開放性讀碼框。ncRNA分為兩類，一類為長度小于200 nt的RNA分子稱為小分子RNA，包括microRNA和小干擾RNA，另一類為長度大于200 nt的RNA分子稱為長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA，lncRNA)。近10年的研究發現大量的小分子RNA在腫瘤的發生、發展中起重要的調控作用，而對lncRNA的發現和功能研究比較少，到目前為止只有十幾種lncRNA的功能研究的比較清楚，近期的研究顯示lncRNA與腫瘤的發生、發展和轉移有一定的相關性［1-2］。本研究通過EST數據庫搜索和電子差異表達差減算法等生物學信息學方法預測了5個可能與鼻咽癌相關的lncRNA，通過熒光定量PCR方法檢測其在細胞株和鼻咽癌組織表達量篩選出與鼻咽癌的相關性lncRNA。

1 材料與方法

1.1 組織標本收集

30例組織標本均取自江西省腫瘤醫院放三科鼻咽鏡室，其中初治鼻咽癌患者20例，鼻咽淋巴組織增生標本10例，所有的組織標本均經過病理學檢查明確診斷。組織標本離體后立即放入無RNA酶的凍存管中，浸入液氮中保存。

1.2 細胞株

鼻咽正常細胞株NP69和鼻咽癌細胞株HK1由本室保存。培養條件NP69用K-SFM培養基(GIBCO公司)，HK1用汗10%滅火胎牛血清的1640培養基(GIBCO 公司)，37 ℃，5%CO2培養。

1.3 方法

1.3.1 RNA提取和純化及cDNA合成 細胞株RNA提取參照TRIZOL試劑(Invitrogen)說明書，組織標本參照微量RNA提取試劑盒(天根生化)提取。所有提取的RNA都用DnaseⅠ去除總RNA中混雜的基因組DNA污染。提取結束后用紫外分光光度儀檢測波長260 nm和280 nm下RNA光密度值，計算出RNA純度并定量。采用隨機引物將純化后的RNA逆轉錄得到cDNA。

1.3.2 實時熒光PCR擴增 PCR引物序列見表1，按照Sybgreen PCR mix試劑盒(Takala公司)說明書的操作步驟進行PCR操作，操作結束后進行溶解曲線分析。

1.3.3 統計學處理 應用SPSS 20.0進行統計學分析，熒光定量PCR數據采用均數±標準差表示，K-S檢驗檢測各種數據是否服從正態分布，組間比較采用t檢驗，檢驗水準為P＜0.05為差異有統計學意義。

表1 PCR引物序列

2 結果

2.1 細胞株中5個lncRNA的表達情況

熒光PCR結果采用2△△ct方法計算各lncRNA的表達情況。結果顯示LINC00520在HK-1中呈低表達，MIR100HG、LINC00340、DNM30S、LINC01135 在HK-1中呈高表達。

2.2 組織lncRNA中5個的表達情況

20例鼻咽癌標本中有5例標本RNA提取失敗，10例鼻咽良性病變標本有2例RNA提取失敗。所有的標本用熒光PCR結果采用2△△ct方法計算各lncRNA的表達情況。將所有標本中的極大值極小值去除，鼻咽癌組和非鼻咽癌組的表達情況見圖1。通過統計學分析發現LINC00340、DNM30S在鼻咽癌組表達水平高于非鼻咽癌組，P值分別為0.014和0.005。LINC00520在非鼻咽癌組表達高于鼻咽癌組，P值為0.038。

圖1 lncRNA在鼻咽癌組和非鼻咽癌組中表達情況

3 討論

近幾年對非編碼RNA尤其是microRNA研究非常廣泛，但是對lncRNA研究較少，尤其是在腫瘤研究領域。Baranova首先使用電子差異表達算法預測腫瘤特異性ESD片段，后來經過對6個沒有編碼蛋白質潛能的ESD片段進行PCR分析，發現計算機預測和實驗結果基本上相互吻合［3-4］。因此本研究通過生物信息學方法預測在鼻咽癌中有差異表達的lncRNA，通過對5個lncRNA進行表達分析，發現3個lncRNA在鼻咽癌與非鼻咽癌之間有差異表達。

在標本RNA的提取過程中如果污染了基因組DNA，在擴增過程中將無法區分擴增信號的真實來源，導致假陽性結果。本研究在PCR擴增過程中采用基因組對照以明確是否有基因組污染導致的假陽性結果。lncRNA不同于mRNA，不一定具備多聚A尾，因此我們使用隨機引物將RNA逆轉錄成cDNA，以減小誤差。

研究顯示lncRNA通過不同的分子機制起不同的生物學作用包括遺傳印跡(如H19 RNA)、反式基因調節(如HOTAIR)、P53應答下調控全基因抑制活動(如linc RNA-p21)、作用于X染色體失活(如Xist)和調節細胞核輸入(如 Nron)。近期研究顯示，H19和 HOTAIR等一些 linc RNA參與腫瘤的發展和轉移［5-6］。本研究發現的3個有差異表達的linc RNA分別為LINC00520、LINC00340、DNM30S。LINC00520 是 2012年新發現的基因，它與西班牙兒童肥胖有相關性［7］，2014年全基因組研究顯示LINC00520與孟加拉國成年人體重相關的一個基因表型［8］。LINC00340目前被認為是抑癌基因，大部分相關研究神經母細胞瘤中有報道，低水平的LINC00340表達與神經母細胞瘤進展有高度相關性，患者預后更差，基因表達分析顯示隨著LINC00340表達的降低，神經母細胞內的分子標志降低，細胞外基質轉錄和細胞粘附能力增加［9-10］。DNM30S可以形成mir199A2前體調節mir199A2/214表達，在卵巢癌干細胞研究中發現mir199A2/214可以調節卵巢癌干細胞的分化，原始卵巢癌干細胞mir199A2/214低表達，成熟的卵巢癌干細胞mir199A2/214高表達［11］。本研究發現的 3個 linc RNA在鼻咽癌的發生、發展、預后中起什么樣的作用還有待于后續的研究。

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