兩種食品防腐劑與牛血清白蛋白相互作用

李 田，程正軍，曹麗君，蔣曉慧

(西華師范大學 a．化學化工學院;b．四川省化學合成與污染控制重點實驗室，四川 南充 637009)

納他霉素(natamycin)和乳酸鏈球菌素(nisin)是常用的食品防腐劑． 例如，Ollé Resa 等［1］報道含有natamycin 的可食性木薯淀粉比直接將它噴灑到奶酪表面對奶酪的防腐效果好． 最近，Zhang 等［2］的研究表明含有nisin 的D-檸檬烯納米乳劑對4 種食品表面上微生物的防腐效果更好． 此外，Kallinteri 等［3］調查了natamycin 與nisin 混合對Galotyri 奶酪保質期的影響，結果發(fā)現(xiàn)直接加入natamycin 或它與nisin 混合對這種奶酪的保質期均比只用nisin 的長． 但是它們對人體健康具有潛在的危害，如natamycin 能引發(fā)姐妹染色單體交換、染色體變異和人淋巴細胞中微核的形成［4］． natamycin/nisin 與蛋白質的相互作用知識對理解natamycin/nisin 的毒理性、特異性、轉移運輸和新陳代謝至關重要． 到目前為止，natamycin/nisin 與蛋白質的相互作用特性仍然未知． 因此，研究蛋白質與natamycin/nisin 間的相互作用具有重要意義．

在血液循環(huán)系統(tǒng)中，血清白蛋白是主要的可溶性蛋白質，在轉移一些有機和無機化合物包括金屬離子方面扮演重要的角色． 在血清白蛋白中，牛血清白蛋白(BSA)已被廣泛用作一個模型來評估蛋白質與有機小分子間的相互作用，因為它與人血清白蛋白的結構相似度高達76%［5］．在本文中，采用多光譜技術(熒光、三維熒光、UV-vis 吸收和FTIR 光譜)探討了natamycin/nisin 與BSA 的結合特性(如:BSA-natamycin/nisin 體系的熒光猝滅機理，結合位點數(shù)，結合力，等)． 此外，幾種常用離子對這兩個綁定反應的影響也被調查．

1 材料與方法

1．1 材 料

BSA (純度98%，M=68 000)購于羅氏公司，且使用前沒有進一步純化;BSA 的溶液在0．05M 的磷酸緩沖液中制備． Natamycin (99%純度)和nisin (99%純度)分別購于阿拉丁化學有限公司和上海樂香生物有限公司． 其它化學藥品均為分析純，無需進一步純化，所有溶液保存在4℃． 整個實驗過程中使用的水均為二次蒸餾水．

1．2 方 法

所有熒光光譜均在Cary Eclipse 熒光分光光度計(Varian，USA)上測量，且該儀器配有電子恒溫裝置．固定BSA 的濃度為5．0μM，natamycin/nisin 的濃度從0 逐漸增加到85．71/375．00μM． 激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均設為5nm，激發(fā)波長設為280nm，通過熒光滴定實驗測定四個溫度下250 -500nm 波長范圍內的熒光光譜，所有熒光滴定實驗均用50μL 微量進樣器手動完成． 此外，記錄250 -350nm 波長范圍內Δλ = 15 和60nm的同步熒光光譜數(shù)據(jù)，而掃描同步熒光光譜的儀器參數(shù)設置與熒光猝滅光譜相同．

三維熒光光譜的掃描速度為24 000nm/min，激發(fā)波長在200 -350nm 范圍內變化，步長為2nm，且在每個激發(fā)波長下記錄200 -500nm 波長范圍內的三維熒光數(shù)據(jù)．

Natamycin/nisin 與BSA 間的位點競爭實驗在3 種位點標記物(phenylbutazone，flufenamic 和digitoxin)存在下用熒光滴定方法完成． 把BSA 與位點標記物分別加入試管中(它們的濃度均為5．0μM，pH=7．4)，然后把natamycin/nisin 溶液逐漸滴加到BSA-phenylbutazone，BSA-flufenamic，或BSA-digitoxin 混合物中，記錄250 -500nm 范圍內的熒光數(shù)據(jù)．

紫外可見吸收光譜在UV-3600 紫外-可見-近紅外光度計上測量． 紅外光譜在Nicolet-6700 FTIR 上通過衰減全反射測定，測量范圍是400 -4 000 cm-1，BSA 與natamycin/nisin 的摩爾比分別為1∶1 和1∶3． 扣除緩沖液和natamycin/nisin 溶液的吸光度值．

2 結果與討論

2．1 Natamycin/nisin 對BSA 的熒光猝滅

在不同濃度natamycin/nisin 的存在下，BSA 的熒光光譜見圖1． 如圖1 所示，BSA 的熒光強度隨natamycin/nisin 加入量增加而逐漸降低，且它的最大發(fā)射波長沒有發(fā)生移動． 該結果表明BSA 與natamycin/nisin間存在相互作用，但是這種相互作用沒有引發(fā)BSA 的變性．

圖1 不同濃度natamycin (a)和nisin (b)與BSA 作用的熒光猝滅光譜圖Fi g.1 Fluorescence quenching spectra of BSA by natamycin (a) and nisin (b)

熒光猝滅機理通常分為動態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅． 動態(tài)猝滅是熒光團和猝滅劑之間碰撞的結果，而靜態(tài)猝滅歸于熒光團和猝滅劑間形成基態(tài)復合物． 熒光猝滅機理可以運用KSV(Stern-Volmer 猝滅常數(shù))值隨溫度變化趨勢來判別，即若KSV值隨著溫度上升而下降則為靜態(tài)猝滅，反之則為動態(tài)猝滅［6］． 為了得到BSA-natamycin/nisin 體系的猝滅機理，對應的熒光光譜數(shù)據(jù)用Stern-Volmer 方程分析:

其中F0和F 是BSA 在加入猝滅劑前后的熒光強度;KSV、Kq和［Q］分別代表Stern-Volmer 猝滅常數(shù)、猝滅速率常數(shù)和猝滅劑濃度;τ0是不存在猝滅劑下蛋白質的平均壽命，生物高聚物的熒光壽命為10-8s． 通過F0/F對［Q］線性擬合圖的斜率計算KSV值，對應的值列于表1． 從表1 中的數(shù)據(jù)可知，BSA-natamycin 和BSA-nisin的KSV值與溫度成負和正相關，表明natamycin 和nisin 與BSA 的猝滅機理是靜態(tài)和動態(tài)猝滅機理． 但是在BSA-nisin 復合物中，靜態(tài)猝滅也不能完全排除，因為它的Kq值遠大于生物分子的最大猝滅常數(shù)2．0 ×1010L·mol-1·s-1［7］． 此外，為了進一步探索這兩個綁定反應能形成復合物，分別測量BSA-natamycin/nisin 體系的共振光散射光譜(圖沒有列出)，BSA 的共振光散射強度隨著natamycin/nisin 濃度增大而逐漸增強，充分說明相互作用過程中確實形成BSA-natamycin/nisin 復合物． 此結果再次證明BSA 與natamycin/nisin 間屬于靜態(tài)猝滅．

表1 在四個不同溫度下，BSA-natamycin/nisin 體系的Stern-Volmer 參數(shù)Tab．1 The parameters for the BSA-natamycin/nisin system at four temperatures

表2 在不同溫度下，BSA-natamycin/nisin 體系的結合常數(shù)Kb、結合位點數(shù)n 和熱力學參數(shù)Tab． 2 The binding constants Kb，the number of binding sites n，and the thermodynamic parameters of BSA-natamycin/nisin system at different temperatures

2．2 BSA 與natamycin/nisin 間的結合常數(shù)和結合位點數(shù)

對一個靜態(tài)猝滅相互作用，假設猝滅過程中有獨立的結合位點，那么結合常數(shù)(Kb)和結合位點數(shù)(n)可以根據(jù)式(2)計算:

其中Kb是BSA 與natamycin/nisin 間的結合常數(shù)，n 是猝滅劑在蛋白分子上的結合位點數(shù)． 不同溫度下的Kb值和n 值可根據(jù)雙對數(shù)擬合直線(式(2))的截距和斜率來估算，結果列于表2．從表2 中數(shù)據(jù)可以看出，相對其它結合親和力強的蛋白質-配體復合物的結合常數(shù)(106-108M-1)［8］，它們的結合常數(shù)值比較低． 且BSA-natamycin 體系的Kb值比BSA-nisin 的Kb值更大，表明BSA 與natamycin 結合比它與nisin 結合力更強．不同溫度下的n 值都接近1，暗示BSA 與natamycin/nisin 間的相互作用有一個結合位點，并且natamycin/nisin 很可能結合到BSA 子域IIA 的疏水腔中，也就是Trp-212．

為了進一步確定natamycin/nisin 在BSA 上的結合位置，進行結合位點取代實驗． 根據(jù)前人研究結果，Phenylbutazone(PB)和warfarin(WF)綁定位點I，ibuprofen(IP)和flufenamic(FA)綁定位點II，digitoxin(DIG)綁定位點III［9］． 因此在本研究中，我們選取3 個不同結合位點的探針(PB、FA 和DIG)，分別將natamycin/nisin 溶液滴加到BSA 與不同位點標記物(BSA 與位點標記物的摩爾比均為1∶1)的混合液中，并用式(2)分析它們對應的熒光猝滅數(shù)據(jù)． BSA-natamycin/nisin-PB 體系的Kb值遠小于BSA-natamycin/nisin 體系的Kb值(表3)，然而，BSA-natamycin/nisin 體系中加與不加FA/DIG 標記物，它們的Kb值沒有明顯變化． 上述結果表明natamycin/nisin 主要與BSA 位點I(子域IIA)中的Trp-212 結合．

表3 不同位點標記物對BSA-natamycin/nisin 體系結合常數(shù)的影響Tab．3 Effects of the site probe on the binding constants of natamycin/nisin to BSA

2．3 BSA 與natamycin/nisin 間的熱力學參數(shù)

有機小分子與生物大分子間的相互作用力主要包括氫鍵、疏水性作用、靜電作用和范德華力．而熱力學參數(shù)(ΔH、ΔS 和ΔG)大小和符號能判定綁定過程中存在的主要結合力類型，這些熱力學參數(shù)通過范特霍夫方程計算［10］，它們對應的值列于表2． 負的ΔG 值表明BSA-natamycin/nisin 復合物的形成是自發(fā)過程． 正的ΔH 和ΔS 值暗示BSA 與natamycin 形成復合物通過疏水性相互作用． 然而，對BSA-nisin 體系，ΔH 和ΔS 都為負值，說明BSA-nisin 復合物形成主要通過氫鍵和范德華力［11］．

2．4 BSA 與natamycin/nisin 間的結合距離

圖2 BSA 熒光發(fā)射光譜(a)與natamycin (b)和nisin (c)紫外可見吸收光譜的重疊圖Fig．2 Spectral overlap of the UV-vis absorption spectra of natamycin (A) and nisin (B)with the fluorescence emission spectrum of BSA

能量共振轉移由供體的熒光發(fā)射光譜和受體的吸收光譜相互重疊產生(圖2)． 根據(jù)福斯特非輻射能量轉移理論，結合距離r 可用以下公式推出［12］:

對BSA，K2= 2/3、N = 1．36 和Φ= 0．15，根據(jù)公式(3)-(5)，計算結果如下:對BSA-natamycin 體系，J= 5．55 ×10-17cm3·L·mol-1，R0= 1．06nm，r = 1．36nm，E = 18．53%;對BSA-nisin 體系，J = 3．73 ×10-16cm3·L·mol-1，R0= 1．46nm，r= 2．06nm，E= 11．16%．結果表明供體和受體間的距離均小于8nm，再次證明BSA 與natamycin/nisin 間的作用是靜態(tài)猝滅． 且BSA-natamycin 的結合距離比BSA-nisin 短，說明BSA-natamycin 間的能量轉移效率比BSA-nisin 高．

2．5 Natamycin/nisin 對BSA 構象的影響

為了探索natamycin/nisin 對BSA 構象的影響，我們分析BSA 加入natamycin/nisin 前和后的紫外可見吸收、同步熒光、三維熒光和紅外光譜．

2．5．1 UV-vis 吸收光譜

UV-vis 吸收光譜是一種簡單、普通和有效的方法對探測蛋白質結構變化和復合物的形成． BSA 的吸收光譜強度隨natamycin/nisin 濃度增大而逐漸上升(圖未列出)，表明BSA 與natamycin/nisin 間形成復合物，且natamycin/nisin 加入導致BSA 的構象變化．

2．5．2 同步熒光光譜

同步熒光光譜能有效評估蛋白質的微環(huán)境變化，而該方法在設置一個固定的波長差(Δλ = λem-λex)后，同步掃描激發(fā)和發(fā)射單色器．最大發(fā)射波長位置移動表明熒光團周圍極性發(fā)生變化． 當Δλ 為15 和60 nm 時，同步熒光分別提供酪氨酸和色氨酸殘基的特性． 在不同natamycin/nisin 濃度存在下，BSA 的酪氨酸和色氨酸殘基熒光光譜對應的最大發(fā)射波長沒有明顯位移(圖未給出)，表明加入natamycin/nisin 后，這兩種氨基酸殘基的微環(huán)境沒有發(fā)生明顯的變化． 但是Δλ = 60 nm 的熒光猝滅強度比Δ λ = 15 nm 大，表明色氨酸殘基固有熒光的猝滅比酪氨酸殘基強，故natamycin/nisin 更靠近色氨酸殘基，即結合位點主要位于色氨酸殘基［13］． 該結果與結合位點競爭實驗結論相一致．

2．5．3 三維熒光光譜

三維熒光光譜通過同時改變激發(fā)和發(fā)射波長探索蛋白質的構象變化，它能提供關于熒光特性的所有信息，所以它是一種有效的方法對蛋白質構象變化的研究． 在三維熒光光譜圖中，若熒光峰的激發(fā)或發(fā)射波長發(fā)生移動，一個新峰出現(xiàn)，或一個存在的峰消失，都表明蛋白質的構象發(fā)生變化． 通過比較BSA 的三維熒光光譜變化(圖3)，我們發(fā)現(xiàn)在natamycin/nisin 存在下，BSA 中峰I(色氨酸和酪氨酸殘基的光譜特性)和峰II(多肽骨架結構特性)的熒光強度均降低;此外，對BSA-nisin 體系，峰I 的最大發(fā)射波長輕微紅移(從340 -345nm)． 上述分析表明加入這兩種防腐劑后導致BSA 的結構變化．

2．5．4 紅外光譜

BSA 與natamycin/nisin 作用的光譜特性可通過紅外光譜方法來描述． 酰胺I 帶(1 700 -1 600 cm-1)歸于C=O 伸縮振動，酰胺II 帶(1 600 -1 480 cm-1)對應于N-H 彎曲和C-N 伸縮［14］． 記錄存在與不存在natamycin/nisin 下BSA 的紅外光譜和對應的差譜(圖未給出)．

當BSA 與natamycin/nisin 的摩爾比率為1∶1 時，峰I 和峰II 帶在1 652cm-1和1 545cm-1處，而在對應的差譜中，正的峰I 和峰II 在1 646 和1 548cm-1(natamycin)，1 648 和1 547cm-1(nisin)，且峰I 和峰II 的強度增強歸因于natamycin/nisin 與蛋白質中C=O、C-N 和N-H 結合． 然而，當BSA 與natamycin/nisin 的摩爾比率降低到1 ∶3 時，在它們差譜中觀察到負的特征峰在1 652 和1 546cm-1(natamycin)，1 651 和1 548cm-1(nisin)． 對BSA-natamycin/nisin 復合物，1 652cm-1處的峰I 帶強度下降，表明在高natamycin/nisin濃度下，BSA 的α-螺旋含量降低．

2．6 共存離子對相互作用的影響

一些常見離子(如:Cu2+、NH4+、Zn2+、Ca2+、Fe3+、K+、Mg2+、Cl-、CH3COO-和C5H7O5COO-)對人體非常重要歸因于它們能參與一些生理作用過程，所以我們討論幾種常見離子對natamycin/nisin 綁定BSA的影響． 結果表明對BSA-natamycin 體系，加入上述任何一種離子，該體系的猝滅常數(shù)均減少;對BSA-nisin體系，分別加入四種離子(Ca2+、Fe3+、K+和Mg2+)后，其猝滅常數(shù)均下降;這可能是共存離子與natamycin/nisin 競爭BSA 上相同的結合位點所致． 然而，對BSA-nisin 體系，在Cu2+、NH4+、Zn2+、Cl-、CH3COO-或C5H7O5COO-存在下，對應的猝滅常數(shù)值均增大，可能是因為金屬離子與nisin 間通過金屬鍵形成復合物，促進nisin 與BSA 的結合，或因為這六種離子改變BSA 的構象，從而導致BSA-nisin 復合物形成更容易在這六種離子存在下． 因此，這些常見離子在血液中可能會延長(使猝滅常數(shù)減小的離子)或縮短(使猝滅常數(shù)增大的離子)食品防腐劑(natamycin 或nisin)的儲存時間． 基于上述分析，在這些常見離子存在下，為了使防腐劑對食品有更好的防腐效果，及時調整它們的劑量是必要的．

圖3 BSA(a)、BSA-natamycin(b)和BSA-nisin (c)的三維熒光光譜圖Fig.3 3D fluorescence spectra of BSA (a), BSA-natamycin (b), and BSA-nisin (c)

3 結 論

作者研究在四種不同溫度下BSA 與natamycin/nisin 間的結合特性． BSA-natamycin 和BSA-nisin 復合物的結合距離分別為1．36 和2．06 nm，說明BSA-natamycin 間的能量轉移效率比BSA-nisin 高． 熱力學參數(shù)表明這兩個結合反應均能自發(fā)進行． natamycin/nisin 最可能綁定BSA 子域IIA 中的Trp-212 殘基． UV-vis 吸收、同步熒光、三維熒光和FTIR 光譜結果表明natamycin/nisin 能改變BSA 的構象． Cu2+、NH4+、Zn2+、Cl-、CH3COO-或C5H7O5COO-離子的加入導致BSA-nisin 復合物的猝滅常數(shù)增大;而對BSA-natamycin 復合物，上述離子使它的猝滅常數(shù)均減小． 這些研究將有助于理解natamycin/nisin 在人體內的轉移、吸收、新陳代謝和毒性，并且確定它們在食品中的劑量．

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