雷爐洗劑微生物限度檢查方法及驗證

李秀珍，宋秀榮，劉風琴，李　文

（德州市食品藥品檢驗檢測中心，山東　德州　253000）

雷爐洗劑微生物限度檢查方法及驗證

李秀珍，宋秀榮，劉風琴，李文

（德州市食品藥品檢驗檢測中心，山東德州253000）

目的建立雷爐洗劑微生物限度檢查方法并進行驗證。方法分別采用常規法、培養基稀釋法、薄膜過濾法對各試驗菌株進行回收率試驗，以驗證已建立方法的科學性和可行性。結果雷爐洗劑對細菌有很強的抑制作用，采用薄膜過濾法，以pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液900 mL為沖洗液，可降低其抑菌性。結論該方法可用于雷爐洗劑的微生物限度檢查。

雷爐洗劑；微生物限度檢查；薄膜過濾法

雷爐洗劑（100 mL含爐甘石15％，雷夫奴爾0.1％），具有止癢、收斂、抗感染等作用。用于治療皮膚濕疹、丘疹、紅斑等皮膚炎癥。本品為外用洗劑，根據《中國藥典》2010年版規定［1］，外用洗劑應進行微生物限度的檢查，但筆者查閱資料，未發現有對該藥品微生物限度檢查方法的報道。經查閱文獻，該藥品對細菌具有一定抑制作用［2，3］，采用常規法難以反應該藥品的真實污染情況［4］。故筆者采用常規法、培養基稀釋法、薄膜過濾法3種方法，對該藥品進行微生物限度檢查方法的驗證［5］，以建立適合該藥品的微生物限度檢查方法。

1　材料與方法

1.1菌種大腸埃希氏菌［CMCC（B）44102］、金黃色葡萄球菌［CMCC（B）26003］、枯草芽孢桿菌［CMCC（B）63501］、白色念珠菌［CMCC（F）98001］、銅綠假單胞菌［CMCC（B）26003］為第三代傳代菌種，均購于中國食品藥品檢定研究院。

1.2培養基營養瓊脂培養基（批號：121203）、玫瑰紅鈉瓊脂培養基（批號：121119）、膽鹽乳糖培養基（批號：1206132）、營養肉湯培養基（批號：121214）均購自北京三藥科技有限公司。

2　方法與結果

2.1菌落計數方法驗證

2.1.1供試液及菌液的制備供試液制備：樣品10 mL，加稀釋液（pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液）至100 mL，混勻，作為1∶10供試液。

菌液制備：接種金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌新鮮培養物至營養肉湯培養基中，35℃培養24 h，接種白色念珠菌新鮮培養物至改良馬丁培養基中，25℃培養24 h，分別取上述培養物1 mL，加無菌生理鹽水9 mL，10倍遞增稀釋成50～100 cfu·mL-1的菌懸液。

2.1.2常規方法試驗組：分別取“2.1.1”項下供試液和菌懸液各1 mL，注入同一個無菌平皿，立即傾注瓊脂培養基15～20 mL。

菌液組：不加供試液，其余同試驗組。

供試品對照組：不加菌懸液，其余同試驗組。稀釋劑對照組：以稀釋劑替代菌懸液，其余同試驗組。

每組平行制備3個平板，營養瓊脂培養基的平皿，35℃培養48 h，傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養基的平皿于25℃培養72 h，點計菌落數，分別按照中國藥品檢驗標準操作規范［5］計算各試驗菌每次試驗的菌落回收率。

2.1.3培養基稀釋法試驗組：取“2.1.1”項下供試液1mL，等量注入5個平皿中，每一平皿加入菌懸液1 mL，其他同常規法操作。

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2.1.4薄膜過濾法試驗組：取“2.1.1”項下供試液1 mL，經孔徑0.45 μm濾膜過濾后以稀釋液900 mL沖洗濾膜，每次100 mL，在最后1次沖洗液中加菌懸液1 mL，濾干并取出濾膜，菌面朝上貼于瓊脂培養基上培養計數。其他同常規法操作。

2.1.5結果各次試驗的稀釋劑對照組回收率均大于70％。3種樣品處理方法對各試驗菌株的回收率結果見表1。

試驗結果表明，雷爐洗劑對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌有較強的抑制作用，其中對金黃色葡萄球菌的抑制作用最強，可采用薄膜過濾法降低其抑菌性。筆者在薄膜過濾法中增加稀釋液的沖洗量至900 mL，分9次等量沖洗；培養基稀釋法取“2.1.1”項下供試液1 mL等量分別注入10個平皿中，兩種方法回收率仍均小于70％。表明本品對金黃色葡萄球菌有非常強的抑菌性，不易被金黃色葡萄球菌污染，故應采用接近70％的薄膜過濾法對本品的細菌進行檢驗［1］。采用常規法對霉菌酵母菌進行檢驗。

表1　3批雷爐洗劑對各實驗菌株的回收率試驗結果（％）

2.2控制菌檢查的方法驗證

2.2.1金黃色葡萄球菌檢查方法驗證

2.2.1.1常規法試驗組：取“2.1.1”項下的1：10供試液10 mL，接種至100 mL營養肉湯中，加入金黃色葡萄球菌10～100 cfu，35℃培養18～24 h，按照《中國藥典》2010年版附錄ⅪJ檢驗，應檢出金黃色葡萄球菌。

陰性對照組：除不加金黃色葡萄球菌外，其余同試驗組，應不得檢出金黃色葡萄球菌。

2.2.1.2培養基稀釋法取“2.1.1”項下的1∶10供試液10 mL，分別接種至200、500、1 000 mL營養肉湯中，其余同常規法。

2.2.1.3薄膜過濾法取“2.1.1”項下的1∶10供試液10 mL，每膜加入金黃色葡萄球菌10～100 cfu，以0.9％的無菌氯化鈉溶液900 mL分9次沖洗，濾后將薄膜置于100 mL營養肉湯中，其余同常規法，結果見表2

2.2.2銅綠假單胞菌檢查方法驗證

2.2.2.1常規法試驗組：取“2.1.1”項下的1∶10供試液10 mL，接種至100 mL膽鹽乳糖培養基中，加入銅綠假單胞菌10～100 cfu，35℃培養18～24 h，按照《中國藥典》2010年版附錄ⅪJ檢驗，應檢出銅綠假單胞菌。

陰性對照組：除不加銅綠假單胞菌外，其余同試驗組，應不得檢出銅綠假單胞菌。

2.2.2.2培養基稀釋法取“2.1.1”項下的1∶10供試液10 mL，分別接種至 200、500 mL營養肉湯中，其余同常規法，結果見表2。

試驗結果表明，金黃色葡萄菌可采用薄膜過濾法檢驗，銅綠假單胞菌可采用培養基稀釋法檢驗。

表2　雷爐洗劑控制菌檢查方法驗證結果

3　結論

筆者采用薄膜過濾法，分別以100、300、500、900 mL為沖洗液，結果顯示沖洗液低于900 mL時，回收率不滿意，故最終確定沖洗體積為900 mL。

雷爐洗劑具有抑菌性，采用常規法檢查會抑制其菌株的生長［6］，不能反映藥品真實污染情況，筆者查閱相關文獻［7～11］采用培養基稀釋法與薄膜過濾法均可降低其抑菌性。試驗最終確定采用薄膜過濾法對細菌進行檢驗，常規法對霉菌酵母菌進行檢驗。采用薄膜過濾法進行控制菌金黃色葡萄球菌的檢驗，采用培養基稀釋法對銅綠假單胞菌進行檢驗。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典2010年版（一部）［S］.北京：中國醫藥科技出版社，2010：附錄ⅪJ.

［2］金濤.爐甘石洗劑微生物限度檢查方法［J］.中國生化藥物雜志，2011，32（6）：480-481.

［3］王菊芳.雷夫奴爾冷濕敷治療葡萄球菌性燙傷樣皮膚綜合征的臨床觀察［J］.家庭護士，2008，6（8）：2195-2196.

［4］陳婷，唐躍年，胡燕鋒.硫酸新霉素口服溶液微生物限度檢查方法及驗證［J］.醫藥導報，2013，32（Suppl）：207-208.

［5］中國藥品生物制品檢定所.中國藥品檢驗標準操作規范［S］.北京：中國醫藥科技出版社，2005：325-334.

［6］鐘長鳴，陳希，吳燕紅.微生物限度檢查和無菌檢查方法驗證中存在的問題［J］.中國藥品標準，2011，12（1）：12-13.

［7］杜平華，朱世真.抗菌藥物微生物限度檢查方法的驗證［J］.中國抗生素雜志，2003，28（5）：311-313.

［8］劉鵬，馬仕洪，戴翚，等.普那霉素片微生物限度檢查方法的建立［J］.藥物分析雜志，2010，30（2）：303-306.

［9］劉廣楨，張冕，胡文紅，等.5種洗劑類醫療機構制劑微生物限度檢查方法驗證［J］.藥學研究，2015，34（6）：332-334.

［10］易大為，陳野，潘強.薄膜過濾法在局部給藥制劑微生物限度檢查中的應用［J］.中國藥事，2008，22（4）：342-345.

［11］韋曦，邱雙成，王翠榮.29種醫院制劑微生物限度檢查方法驗證［J］.中國藥房，2008，19（1）：52-54.

The method of microbial limit examination and verification of Ray Furnace Lotion

LI Xiu-zhen，SONG Xiu-rong，LIU Feng-qin，LI Wen
（Dezhou Municipal Food and Drug Inspection Center，Dezhou 253000，China）

Objective To establish and validate the method of microbial limit test of Ray Furnace Lotion.Methods Routine method，membrane filtration method，culture medium dilution method were used for each test strain recovery experiments，to verify the scientific and feasible of the established method.Results Ray Furnace Lotion had a strong inhibitory effect on bacteria，membrane filtration method was used with pH 7.0 sodium chloride-peptone buffer 900 mL as flush fluid，can reduce its antibacterial activity.Conclusion The method can be used for microbial limit test of Ray Furnace Lotion.

Ray Furnace Lotion；Microbial limit test；Membrane filtration method

R927.11

A

2095-5375（2015）12-0709-003

李秀珍，女，研究方向：藥學檢驗，E-mail：lixiuzhen019851216@163.com