上皮性卵巢癌組織中ATG5、Beclin1與P53的表達及相關性研究

曹蒙 趙書君 郭歡歡 劉星爍 韓會會 張敏 李紅雨

(鄭州大學第三附屬醫院 婦產科 河南鄭州 450052)

上皮性卵巢癌是婦科常見的惡性腫瘤之一，死亡率居婦科腫瘤首位。因缺乏早期診斷指標，多數患者確診時已屬晚期，5年生存率不超過30%［1］。近年研究表明，自噬是細胞內物質代謝的一條重要途徑，自噬調控機制的失活與腫瘤的發生發展密切相關［2－3］。自噬相關基因ATG5、Beclin1是參與自噬調節的關鍵基因，P53是參與腫瘤發生、發展及細胞凋亡的重要基因。已有研究顯示ATG5除參與自噬過程外，在促凋亡進程中也起到重要作用［4］。而目前關于ATG5在上皮性卵巢癌中的表達及其與P53表達相關性研究較少，因此本研究采用免疫組化SP法及RTPCR檢測ATG5、Beclin1及P53在不同卵巢組織的表達，探討ATG5、Beclin1在上皮性卵巢癌發生、發展中的作用及其與P53的關系，旨在為卵巢癌的治療尋找新的方向。

1 材料與方法

1.1 標本采集 收集鄭州大學第三附屬醫院和第一附屬醫院2013年9月至2015年6月的84例標本，其中上皮性卵巢癌標本34例，良性卵巢組織及正常卵巢組織各25例，正常卵巢組織來源于因子宮肌瘤、子宮腺肌癥等行子宮及單/雙附件切除者的卵巢。惡性卵巢組織中漿液性癌20例;黏液性癌7例;其他類型7例;按國際婦產科(FIGO 2000)臨床分期及病理分級標準:Ⅰ期5例，Ⅱ期9例，Ⅲ期9例，Ⅳ期11例;G19例，G211例，G314例。標本經病理學證實，均未接受術前放療、化療。

1.2 主要試劑 免疫組化主要試劑:ATG5、Beclin1及P53多克隆抗體(武漢三鷹生物科技公司);兩步法兔/鼠通用免疫組化試劑盒(武漢三鷹生物科技公司)RTPCR主要試劑:RNA提取試劑盒(康為世紀)、反轉錄試劑盒(TOYOBO)，引物合成(金瑞斯生物科技)。

1.3 研究方法

1.3.1 免疫組化染色檢測 采用免疫組化SP法，按照試劑盒方法進行操作。石蠟切片常規脫蠟水化，置于枸櫞酸緩沖液中煮沸進行抗原修復，然后逐步滴加過氧化物酶阻斷劑(37°避光20 min)，血清封閉(1%脫脂奶粉避光30 min)，一抗(4°孵育過夜)，二抗(37°孵育30 min)，DAB染色，蘇木紫復染，脫水，透明，封片。以PBS代替一抗作陰性對照。

判斷標準:陽性結果判定:胞質或胞核內出現棕黃色顆粒為陽性。依照切片中細胞的染色強度(抗原含量)和陽性細胞總數進行分析。每張切片至少觀察5～10個高倍鏡視野。細胞陽性著色程度:背景清晰無色為0分，輕度著色為1分;中度著色為2分;重度著色為3分。陽性細胞數量:①1分:陽性細胞數＜25%;②2分:陽性細胞數25%～75%;③3分:陽性細胞數＞75%。①+②為0～2分，計作免疫組織染色陰性，3～6分計作免疫組織染色陽性。

1.3.2 RT－PCR方法 ①組織RNA的提取:將組織在液氮中磨碎，每50～100 mg組織加入1 ml RNA提取液，溶液裂解后經氯仿等提取細胞總RNA以DNA/RNA測定儀測定RNA的純度和濃度，調整mRNA濃度在1.8～2.0。②cDNA的合成按反轉錄試劑盒說明進行。③引物設計見表1，以NADPH作為內參照，反應體系為:2×PCRMaster－Mix 10μl，上、下游引物各0.6μl，cDNA模板10μl，去離子水8.4μl，總體積為20μl。PCR條件為:95℃1 min，95℃15 s，60℃45 s，共40個循環。每個樣本設置3個復孔，同時設置無cDNA模板的空白對照。記錄每個反應管中的熒光信號達到所設定的閾值時所經歷的循環數(即CT值)。用2－△△CT表示mRNA的相對表達量(△CT=CT目的基因－CT內參，△△CT=△CT實驗組－△CT對照組)。

表1 ATG5、Beclin1及P53的引物設計

1.4 統計學分析 應用SPSS 16.0軟件進行統計學處理，RT－PCR數據采用t檢驗，陽性率比較采用Fisher確切概率法，相關性檢驗采用Spearman法，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 免疫組化

2.1.1 ATG5、Beclin1及P53在不同卵巢組織中的表達 ATG5、Beclin1的表達主要在細胞質內，P53主要表達在胞核內，見圖1。ATG5、Beclin1在正常卵巢組織、良性卵巢腫瘤組織及卵巢癌組織中的表達陽性率，兩兩比較差異均有統計學意義(P＜0.05)。P53在卵巢癌組織中的表達陽性率與良性卵巢組織、正常卵巢組織相比，差異有統計學意義(P＜0.01)，而良性卵巢組織與正常卵巢組織表達陽性率比較，差異無統計學意義(P＞0.05)。見表2。

2.1.2 卵巢癌組織中ATG5、Beclin1和P53的表達與臨床病理特征的關系 不同臨床分期、病理分期的卵巢癌組織中的ATG5、Beclin1及P53的表達比較，差異均有統計學意義(P＜0.05)，而不同年齡、病理類型及淋巴轉移的ATG5、Beclin1及P53的表達比較，差異均無統計學意義(P＞0.05)。見表3。

2.1.3 上皮性卵巢癌組織中ATG5、Beclin1及P53蛋白表達的相關性 Spearman相關性分析顯示，上皮性卵巢癌組織中ATG5與Beclin1蛋白表達呈正相關、ATG5與P53、Beclin1與P53蛋白表達均呈負相關(P＜0.05)。見表4、表5。

表2 ATG5、Beclin1及P53在不同卵巢組織中的表達陽性率(n，%)

表3 卵巢癌組織中ATG5、Beclin1和P53的表達與臨床病理特征的關系(n，%)

表4 上皮性卵巢癌組織中P53與ATG5、Beclin1蛋白表達的相關性

表5 上皮性卵巢癌組織中ATG5與Beclin1蛋白表達的相關性

2.2 RT－PCR 上皮性卵巢癌組織中ATG5、Beclin1的表達低于良性卵巢腫瘤組織及正常卵巢組織，良性卵巢組織低于正常卵巢組織(P＜0.05)。上皮性卵巢癌組織中P53的表達高于良性卵巢組織及正常組織(P＜0.05)，但良性卵巢組織與正常卵巢組織相比，差異無統計學意義(P＞0.05)。見表6。

3 討論

在真核細胞中，自噬是細胞通過降解自身胞質中的部分蛋白和部分細胞器以度過饑餓，并清除氧化損傷的異常大分子及細胞器，從而在應激中維持細胞穩態的過程［5］。目前關于腫瘤細胞自噬的研究報道不一，有研究表明腫瘤細胞的自噬活性降低，也有研究顯示某些腫瘤細胞保持了較高的自噬活性，如胃癌、結腸癌、肝癌、乳腺癌、宮頸癌等［6－7］。

表6 ATG5、Beclin1與P53在不同卵巢組織中mRNA的相對表達量(±s)

表6 ATG5、Beclin1與P53在不同卵巢組織中mRNA的相對表達量(±s)

類別 n ATG5 Beclin1 P53卵巢癌組織25 0.256±0.076 0.234±0.047 0.843±0.134良性卵巢組織 25 0.514±0.016 0.536±0.066 0.252±0.113正常卵巢組織34 0.613±0.057 0.624±0.027 0.236±0.089

圖1 ATG5、Beclin1及P53在不同卵巢組織中的蛋白表達情況(×400)

ATG5是調控自噬的重要基因，在自噬體膜的延伸階段需要2個類泛素蛋白質系統介導:ATG5－Atg12結合系統和ATG8－PE結合系統。ATG5與Atg12形成的復合物定位于自噬體的表面，促進自噬體膜的延伸擴張，誘導自噬體的形成，是自噬體形成的必要因素［8］。Beclin1是第一個發現的哺乳動物自噬基因。研究表明，Beclin1主要對自噬體的形成和成熟進行調控，進而誘導自噬以促進腫瘤細胞凋亡，并抑制其增殖功能［9］。P53在自噬中也發揮著重要的作用，在細胞核中P53可通過激活mTOR上游一些調節因子而上調細胞自噬，這些因子主要包括PTEN、AMPK、TSC2、sestrin1和sestrin2等;而在細胞質中，P53對細胞自噬具有負性調節作用，可抑制細胞自噬的發生。雖調節機制復雜，但P53突變可使P53介導自噬發生改變導致腫瘤發展［10］。

本研究顯示，在卵巢癌組織中ATG5、Beclin1呈低表達，P53呈高表達，且隨病理分期的改變而不同。ATG5與Beclin1呈正相關，二者與P53呈負相關。在正常情況下，機體通過細胞自噬清除衰老的細胞器，維持自我更新。當腫瘤細胞增殖活躍時，引起P53的活性改變，P53促使自噬相關基因ATG、Beclin1表達降低，從而降低腫瘤本身的自噬活性。由于腫瘤細胞凋亡不足、自噬功能下降，導致本應該通過凋亡或自噬性死亡的細胞不能發生凋亡或自噬性死亡，引起細胞異常增多，最終導致癌變。

綜上所述，卵巢癌自噬相關基因ATG5、Beclin1與凋亡相關基因P53在卵巢癌的發生、發展中起協調作用，對其進行聯合檢測，有助于了解和判斷卵巢癌的進展程度及患者的預后情況，為尋找治療卵巢癌提供新的治療靶點。

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