小分子靶向受體酪氨酸激酶抑制劑TW9183的合成及體外抗腫瘤活性

雷春花，王雪玉，楊育才，吳振，王立強

（1.華僑大學 生物醫學學院，福建 泉州362021；2.臺灣大學 生化科學系，臺灣 臺北106170；3.廈門大學 藥學院，福建 廈門361101）

目前，酪氨酸激酶是國際上抗腫瘤藥物研發的重要靶點［1］.吉非替尼是一種苯胺喹唑啉類酪氨酸激酶抑制劑［2］，于2003年獲美國食品和藥物管理局批準上市，作為非小細胞肺癌的靶向治療藥物.喹唑啉類化合物的構效關系表明，藥效母核喹唑啉環上3－位的N 原子可被C 取代，形成具有較強藥理活性的喹啉類化合物［3］.研究表明，苯胺嘧啶類化合物也是一類重要的蛋白激酶抑制劑，對多種蛋白激酶有較好的抑制效果，許多已上市和臨床階段的藥物中含有此結構單元［4］.課題組以吉非替尼為先導，以喹啉環替代喹唑啉，在外側苯環的4－位引入不同的苯胺嘧啶化合物，合成了一系列結構新穎的喹啉衍生物.經前期體外活性驗證與計算機輔助的結構優化，篩選出候選藥物TW9183，其化學名稱為4－（7－氯喹啉－4－氨基）－N－｛4－甲基－3－［4－（4－吡啶）嘧啶－2－氨基］苯基｝苯甲酰胺，分子式為C32H24ClN7O.本文對TW9183的合成方法及其對3種人類腫瘤細胞株的體外抗腫瘤作用進行研究.

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

人宮頸癌Hela、人非小細胞肺癌A549、人肝癌SMMC－7721、HUVEC 細胞株（上海中科院細胞庫）；MEM，F－12K 和RPMI－1640培養基（美國Invitrogen公司）；四甲基偶氮唑鹽（MTT，美國Sigma公司）；胎牛血清（美國Hyclone公司）；二甲基亞砜（DMSO，美國Amresco 公司）；結晶紫、Hoechst 33342染色液、細胞周期與細胞凋亡檢測試劑盒、超敏ECL化學發光試劑盒（上海市碧云天生物技術研究所）；兔抗人Caspase－3抗體、兔抗人Actin抗體、辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗（美國Abcam 公司）；吉非替尼（遼寧省大連美侖生物技術有限公司）；其他合成試劑（上海泰坦科技股份有限公司）.

PB－10型pH 計、BS 224S型電子天平（德國Sartorius公司）；Infinite M200型全功能酶標儀（西班牙Tecan Iberica公司）；Eclipse TE2000－U 型熒光倒置顯微鏡（日本Nikon公司）；ChemiDoc XRS型凝膠成像系統、Mini－PROTEAN Tetra C型垂直板電泳和轉膜裝置（美國Bio－Rad公司）；FACS Calibur型流式細胞儀（美國BD 公司）；FRESCO 21型離心機（美國Thermo公司）；WRR 型熔點儀（上海精密科學儀器有限公司）；Vario EL Ⅲ型元素分析儀（德國Elementar公司）；N－1001型旋轉蒸發儀（日本東京理化器械株式會所）；UNION 400型氫譜、碳譜（美國Varian公司）；Esquire 3000plus型質譜儀（美國Bruker公司）.

1.2 TW9183的合成

化合物TW9183的合成路線，如圖1所示.

圖1 TW9183的合成路線Fig.1 Synthesis route of TW9183

1.2.1 4－（7－氯喹啉－4－氨基）苯甲酸（Ⅰ）的合成 在100mL 的圓底燒瓶中加入4，7－二氯喹啉1.96g（10mmol）、對氨基苯甲酸1.36g（10mmol）和異丙醇（i－PrOH）20mL，攪拌使其充分溶解.緩慢升溫至85 ℃，攪拌回流5h，薄層色譜（TLC）監測反應完全后，將反應液冷卻至室溫，減壓蒸干，殘留固體用30 mL二氯甲烷洗滌2次，抽濾得黃色固體中間體（I）4－（7－氯喹啉－4－氨基）苯甲酸2.68g，收率為90%.

1.2.2 4－（7－氯喹啉－4－氨基）苯甲酰氯（Ⅱ）的合成 在100mL 干燥的圓底燒瓶中加入含2.982g（10 mmol）中間體I的干燥二氯甲烷溶液15mL，攪拌，0 ℃冰浴下緩慢滴加氯化亞砜5.35g（45mmol），回流3h，減壓蒸餾，得到淡黃色固體中間體（Ⅱ）4－（7－氯喹啉－4－氨基）苯甲酰氯2.71g，收率為95%.

1.2.3 TW9183的合成 在100mL干燥的圓底燒瓶中加入含中間體Ⅱ3.162g（10mmol）及2－（5－氨基－2－甲基苯胺）－4－（4－吡啶）嘧啶2.35g（8.5mmol）的四氫呋喃溶液40mL，攪拌.0 ℃冰浴下緩慢滴加三乙胺（Et3N）1.717g（17mmol），攪拌30min，45℃下反應7h.TLC檢測反應完全后，抽濾，濾液減壓蒸餾，固體用50mL 乙酸乙酯溶解，80mL 水萃取2次，合并有機相，無水硫酸鈉干燥，減壓蒸餾，用二氯甲烷／甲醇重結晶，得目標產物（TW9183）4.02g，收率為85%，熔點為292～296 ℃.

1.3 細胞培養

Hela，SMMC－7721，A549和HUVEC 細胞株分別接種于含體積分數為10%胎牛血清的MEM，RPMI－1640，F－12K 培養基中，置于37 ℃，體積分數為5% 的二氧化碳培養箱中培養，所有實驗均采用對數生長期細胞.

1.4 MTT法測定細胞的增殖能力

將Hela，A549，SMMC－7721，HUVEC細胞以4×103個·孔－1接種于96孔培養板中.細胞完全貼壁后，分別給予不同濃度的TW9183（2，4，8，16μmol·L－1）.陽性對照組給予相同濃度的吉非替尼，陰性對照組給予相同體積的DMSO，培養48h后加MTT 檢測，計算半數抑制濃度（IC50）和相對細胞增殖率（RGR），實驗重復3次.

1.5 平板克隆法測定細胞的克隆形成能力

將Hela，A549，SMMC－7721細胞以300個·孔－1接種于6孔板中.細胞完全貼壁后，藥物處理同節1.4.48h后更換培養液，培養至培養板中出現肉眼可見的集落時終止，棄培養液，用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗1次，加入1mL質量分數為4%的多聚甲醛固定10min，棄多聚甲醛，PBS洗2～3次，加600 μL結晶紫染色液染色10min，流水洗去結晶紫，空氣中干燥，計算克隆形成率，實驗重復3次.

1.6 劃痕法測定細胞的遷移能力

將Hela，A549，SMMC－7721細胞以1×105個·孔－1接種于24孔板中.細胞完全貼壁后，用200 μL移液槍槍頭在單層細胞上呈"一"字劃痕，棄培養液，PBS洗2次，藥物處理同節1.4.48h后，置于倒置顯微鏡下觀察并測量細胞發生遷移后的損傷距離，計算遷移率，實驗重復3次.

1.7 Hoechst 33342法檢測凋亡細胞形態

將Hela，A549，SMMC－7721細胞以4×103個·孔－1接種于96孔板中.細胞完全貼壁后，藥物處理同節1.4.48h后吸棄培養液，每孔加入100μL質量分數為4%的多聚甲醛固定30min，吸棄多聚甲醛，PBS蕩洗，每孔加入80μL Hoechst 33342染色10min，吸棄染色液，PBS蕩洗，于熒光顯微鏡下觀察，實驗重復3次.

1.8 蛋白免疫印跡檢測caspase-3蛋白的表達

將Hela，A549，SMMC－7721細胞以5×105個·孔－1接種于96孔板中.細胞完全貼壁后，分別給予不同濃度的TW9183（4，8，16μmol·L－1），陰性對照組給予同體積的DMSO.48h后吸棄培養基，PBS洗滌2次，每孔加入150μL Western及IP細胞裂解液，冰浴裂解30min，1 000r·min－1離心5min，收集上清液，凝膠電泳分離蛋白.將蛋白轉印至聚偏二氟乙烯膜上，質量分數為5%脫脂奶粉封閉后，一抗4 ℃封閉過夜，二抗室溫封閉2h，ECL顯色1～2min，熒光成像儀內曝光、檢測，實驗重復3次.

1.9 流式細胞術檢測細胞周期分布

將Hela，A549，SMMC－7721細胞以2×105個·孔－1接種于6孔板中.細胞完全貼壁后，藥物處理同節1.4.48h后消化并收集細胞，4℃固定過夜，加入0.5mL配制好的染色液（含PI，RNA 酶，染色緩沖液），緩慢并充分重懸細胞沉淀，于37 ℃避光溫浴30min，用流式細胞儀檢測，實驗重復3次.

2 結果與討論

2.1 TW9183的合成及結構鑒定

TW9183的詳細合成路線，如圖1所示.中間體I的結構經1H－NMR，13C－NMR 和ESI－MS表征確證，目標產物的結構經IR，1H－NMR，13C－NMR，ESI－MS和元素分析表征確證，具體結果如下所述.

4－（7－氯喹啉－4－氨基）苯甲酸（Ⅰ）為黃色固體粉末，收率為90%.1H－NMR（400MHz，DMSO－d6），δ值：8.61（d，J＝9.29Hz，1H），8.47（d，J＝7.03 Hz，1H），8.23～8.26（m，2H），8.00（d，J＝2.01 Hz，1H），7.86（dd，J＝9.29Hz，2.26Hz，1H），7.63（dd，J＝6.78Hz，2.01Hz，2H），7.11（d，J＝7.03Hz，1H）.13C－NMR（400MHz，DMSO－d6），δ值：168.41，150.39，149.52，148.36，147.21，136.12，132.15，130.21，126.83，123.29，21.38，18.26，115.17，112.85.ESI－MS，m／z為298.7［M－H］－.

4－（7－氯喹啉－4－氨基）苯甲酰氯（Ⅱ）為淡黃色固體粉末，收率為95%.

4－（7－氯喹啉－4－氨基）－N－｛4－甲基－3－［4－（4－吡啶）嘧啶－2－氨基］苯基｝苯甲酰胺（TW9183）為淡黃色的固體粉末，收率為85%，其熔點為292～296℃.IR（KBr），σ／cm－1：3 447，3 427，3 372，3 226，3 065，3 014，1 625，1 595，1 574，1 507，1 427，1 386，1 361，1 313，1 225，1 166，1 020，746.1H－NMR （400 MHz，DMSO－d6），δ值：2.25（s，3H），7.01（d，J＝7.00Hz，1H），7.24（d，J＝8.54Hz，1H），7.47（d，J＝5.26Hz，1H），7.51（dd，J＝8.04Hz，2.04 Hz，1H），7.64（d，J＝7.76 Hz，1H），7.65（d，J＝8.76 Hz，2H），7.93（dd，J＝9.04Hz，2.00Hz，1H），8.12（d，J＝2.24Hz，1H），8.14（d，J＝2.04Hz，1H），8.18（d，J＝8.54Hz，2H），8.55（d，J＝5.26Hz，1H），8.62（dd，J＝6.14Hz，2.00Hz，1H），8.63（d，J＝6.8Hz，1H），8.76（d，J＝4.76Hz，1H），8.79（d，J＝9.04 Hz，1H），9.06（s，1H），9.34（s，1H），10.36（s，1H），11.14（s，1H）.13C－NMR（400 MHz，DMSO－d6），δ值：18.11，101.36，108.11，116.73，117.36，117.78，119.96，124.79，125.06，126.37，128.14，128.27，129.92，130.58，133.19，134.04，136.25，137.52，138.23，139.14，139.59，140.35，144.47，147.57，150.63，155.00，158.68，159.02，160.01，161.58，161.64，164.88.ESI－MS，m／z為558.2［M＋H］＋.Anal.（C32H24ClN7O）：calcd C 68.87，H 4.30，Cl 6.37，N 17.58，O 2.87；found C 68.79，H 4.32，Cl 6.35，N 17.56，O 2.88.

2.2 TW9183對腫瘤細胞和HUVEC細胞增殖的影響

給藥48h后，陰性對照組細胞均貼壁生長旺盛，細胞呈多角形，胞質飽滿，相鄰細胞生長融合成片，而給藥組細胞隨著給藥濃度的增加細胞數明顯減少，Hela細胞發生皺縮，逐漸漂浮起來，A549 和SMMC－7721細胞體積變大，扁平鋪展.以細胞膨大為特征的細胞衰老是一種重要的抑瘤機制［4］.因此，TW9183可能通過促進A549和SMMC－7721細胞的衰老達到抑制腫瘤的效果.TW9183對人腫瘤細胞的抗增殖作用，如表1所示.由表1可知：TW9183對Hela，A549和SMMC－7721 腫瘤細胞株表現出比吉非替尼更高的抑制力，表明TW9183可能具有潛在對宮頸癌、肺癌和肝癌的治療作用.TW9183對HUVEC細胞相對增殖率的影響，如圖2所示.由圖2可知：TW9183作用后的HUVEC細胞相對增殖率較大，與陰性對照組差異無統計學意義（P＞0.05），表明TW9183對正常HUVEC細胞在化合物作用范圍內沒有毒性.

表1 TW9183對人腫瘤細胞的 抗增殖作用（n＝3）Tab.1 Anti－proliferation activity of TW9183on human tumor cells（n＝3）

2.3 TW9183對腫瘤細胞克隆形成的影響

腫瘤細胞的克隆形成能力反映了細胞的群體依賴性和增殖能力，是腫瘤細胞成瘤的一個重要因素.TW9183作用于腫瘤細胞后，細胞的克隆形成能力不同程度地減弱，其中，TW9183降低Hela腫瘤細胞集落形成能力最為顯著.對3種腫瘤細胞集落形成的統計值（η1），如圖3所示.圖3中：橫坐標1～5分別代表0，2，4，8，16μmol·L－1的TW9183，6代表16μmol·L－1的吉非替尼；與陰性對照組相比，a代表P＜0.05，b代表P＜0.01；與相同濃度吉非替尼組（16.0μmol·L－1）相比，c代表P＜0.01.由圖3可知：TW9183抑制Hela，A549和SMMC－7721克隆形成的作用效果強于吉非替尼.

圖2 TW9183對HUVEC細胞相對增殖率的影響Fig.2 Effects of TW9183on relative growth rate in HUVEC cell

圖3 TW9183對Hela，A549和SMMC－7721細胞克隆形成的影響Fig.3 Effects of TW9183on colony formation in Hela，A549and SMMC－7721cells

2.4 TW9183對腫瘤細胞遷移的影響

腫瘤轉移是腫瘤致死的主要原因［5－6］，也是人們防治腫瘤時關注的重要因素.TW9183能不同程度地抑制Hela，A549和SMMC－7721細胞的遷移，其影響如圖4所示.圖4中：A，B，C，D，E 分別為0，2，4，8，16μmol·L－1的TW9183，F為16μmol·L－1的吉非替尼（×100）.給藥48h后，陰性對照組的劃痕寬度不斷縮小，而給藥組隨著給藥濃度的增加，劃痕愈合程度逐漸降低，細胞遷移率（η2）明顯降低，與陰性對照組相比具有統計學意義（P＜0.01），且高劑量組TW9183（16.0μmol·L－1）作用后的Hela細胞遷移率明顯低于吉非替尼對照組（P＜0.05），但對A549和SMMC－7721細胞的遷移抑制作用與吉非替尼組無統計學意義.TW9183對Hela，A549和SMMC－7721細胞遷移率的影響，如圖5所示.圖5中：1～5分別代表濃度為0，2，4，8，16μmol·L－1的TW9183，6代表濃度為16μmol·L－1的吉非替尼；與陰性對照組相比，b代表P＜0.01；與相同濃度吉非替尼（16.0μmol·L－1）組相比，c代表P＜0.05.

2.5 TW9183對腫瘤細胞凋亡的影響

圖4 TW9183對Hela，A549和SMMC－7721細胞遷移的影響Fig.4 Effects of TW9183on migration in Hela，A549，and SMMC－7721cells

圖5 TW9183對Hela，A549和SMMC－7721細胞遷移率的影響Fig.5 Effects of TW9183on migration rate in Hela，A549，and SMMC－7721cells

TW9183作用于3種腫瘤細胞后，細胞數明顯減少，熒光強度增加，而陰性對照組細胞的細胞核形態規則，熒光較弱，且著色均勻.不同濃度的TW9183和吉非替尼可使部分細胞出現致密濃染或碎塊狀致密濃染，表明藥物作用后細胞凋亡增加.其中，Hela細胞凋亡效果較明顯，其結果如圖6所示.圖6中：A～E分別為0，2，4，8，16μmol·L－1的TW9183，F為16μmol·L－1的吉非替尼（×100）.

2.6 TW9183對腫瘤細胞caspase-3蛋白表達的影響

細胞凋亡有多種因素參與，其中，caspase－3蛋白酶在凋亡信號傳導中起核心作用［7］.它在細胞內以無活性的前體（酶原）形式存在，激活后導致凋亡的發生.TW9183對Hela，A549和SMMC－7721細胞caspase－3蛋白表達的影響，如圖7所示.由圖7可知：不同濃度的TW9183作用3種腫瘤細胞48h后，隨TW9183濃度的增大，caspase－3蛋白相對分子量32kD 的酶原表達量逐漸減少，17kD 的活性成分表達量逐漸增加，提示TW9183作用于腫瘤細胞后可激活caspase－3，發揮促進腫瘤細胞凋亡的效應.

圖6 TW9183對Hela細胞 凋亡的影響Fig.6 Effects of TW9183on nuclear apoptosis in Hela cells

圖7 TW9183對Hela、A549和SMMC－7721細胞caspase－3蛋白表達的影響Fig.7 Effects of TW9183on expression of caspase－3 protein in Hela，A549and SMMC－7721cells

2.7 TW9183對腫瘤細胞周期分布的影響

與陰性對照組相比，各濃度TW9183作用后，腫瘤細胞的G2／M 期細胞比率均有不同程度的增加，且該結果呈現劑量依賴性，表明TW9183主要誘導腫瘤細胞阻滯于G2／M 期；而吉非替尼主要將細胞周期阻滯于G0／G1 期，二者阻滯的細胞周期不同，有待進一步研究.

3 結論

文中合成的目標化合物是一種新的喹啉衍生物.紅外光譜、碳譜、氫譜、電噴霧質譜及元素分析結果證實該化合物與所設計的TW9183結構相符，其收率達到85%.此法操作簡便，原料便宜易得，反應效率高，易于進行工業化生產.

細胞異常增殖、遷移以及細胞去分化都是腫瘤形成的重要原因［8］.通過MTT、平板克隆、劃痕實驗等證實，TW9183對Hela，A549和SMMC－7721細胞的增殖、遷移均有一定的抑制作用.Hoechst 33342染色、Western blot和流式細胞術還表明：TW9183不同程度地促進這3種細胞的凋亡，將細胞周期阻滯在G2／M 期.所有實驗均證實TW9183較吉非替尼表現出更強的體外抗腫瘤活性，但其抗腫瘤作用機制及體內動物實驗還需后續繼續研究.

［1］WEI L，MALHOTRA S V.Recent development of cyclic amide（pyridone／lactam）moiety containing heterocycles as protein kinase inhibitors［J］.Current Medicine Chemistry，2010，17（3）：234－253.

［2］WEICKHARDT A J，TEBBUTT N C，MARIADASON J M.Strategies for overcoming inherent and acquires resistance to EGFR inhibitors by targeting downstream effectors in the RAS／PI3K pathway［J］.Current Cancer Drug Targets，2010，10（8）：824－833.

［3］SAVAGE D G，ANTIMAN K H.Imatinib mesylate：A new oral targeted therapy［J］.New England Journal of Medicine，2002，346（9）：683－693.

［4］CHEN H Y，LEE Y R，CHEN R H.The functions and regulations of DAPK in cancer metastasis［J］.Apoptosis，2014，19（2）：364－370.

［5］TANAKA T，YUI Y，NAKA N，et al.Dynamic analysis of lung metastasis by mouse osteosarcoma LM8：VEGF is a candidate for anti－metastasis therapy［J］.Clinical and Experimental Metastasis，2013，30（4）：369－379.

［6］MATTHEW B，LUIS R M，REBEKA L D G，et al.Caspase－9，caspase－3and caspase－7have distinct roles during intrinsic apoptosis［J］.BMC Cell Biology，2013（14）：32.

［7］ANTO R J，MUKHOPADHYAY A，DENNING K，et al.Curaim in（diferuloylmethane）induces apoptosis through activation of caspase－8BID cleavage and cytochrome C release its suppression by ectopic expression of bcl－2 and bcl－xl［J］.Carcinogenesis，2002，23（1）：143－150.

［8］EOM Y W，KIM M A，PARK S S，et al.Two distinct modes of cell death induced by doxorubicin：Apoptosis and cell death through mitotic catastrophe accompanied by senescence－like phenotype［J］.Oncogene，2005，24（30）：4765－4777.