雌激素受體基因與微小RNA在冠心病中的相關(guān)性

馬波江 曹 曄 朱 艷 (榆林市第一醫(yī)院心血管內(nèi)科，陜西 榆林 719000)

流行病學(xué)研究表明，絕經(jīng)前婦女冠心病(CAD)和心肌梗死等疾病的發(fā)病率比同齡男性低〔1〕，然而，心血管疾病的發(fā)病率和死亡率在絕經(jīng)后急劇增加，提示內(nèi)源性雌激素可以保護婦女免受CAD〔2〕。一項隨機對照的預(yù)防試驗結(jié)果顯示，雌激素加孕激素的治療方案帶來的健康風(fēng)險大于收益，表明激素治療并不能減少女性CAD事件的風(fēng)險〔3〕。已經(jīng)證實雌激素對心血管功能取決于編碼雌激素受體(ER)的基因——ESR1和ESR2，分別編碼了ERα和ERβ〔4〕。ERα參與血管舒張、心肌細胞凋亡、刺激新血管的形成，在對心臟的保護上發(fā)揮了比ERβ更為重要的作用。系統(tǒng)和局部的炎癥反應(yīng)在CAD的發(fā)病機制中起著重要的作用，但是循環(huán)的白細胞與CAD的發(fā)病機制之間的關(guān)系仍未闡明。微小RNA(miRNA)是一類具有組織特異性或發(fā)育階段特異性表達的內(nèi)源性單鏈非編碼小RNA，通過與靶mRNA完全或不完全互補配對，導(dǎo)致靶mRNA降解或抑制其翻譯〔5〕。人類約有3%的DNA序列編碼在進化過程中高度保守的miRNA序列〔6〕，以往認為這類小RNA片段多是一些無意義片段。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)這類小RNA片段在多種生命活動及重要病理生理事件的發(fā)生發(fā)展過程中具有重要意義。本研究驗證預(yù)測的冠心病miRNA與ESR1基因之間的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2013年4月至2014年10月西安市中心醫(yī)院的30例正常健康人外周血白細胞作為對照組，年齡42～55歲，平均(48.7±2.6)歲;其中男15例，女15例;30例CAD患者外周血白細胞作為實驗組，年齡40～53歲，平均(46.4±5.3)歲;其中男15例，女15例。

1.2 芯片數(shù)據(jù) 芯片數(shù)據(jù)GSE12288下載至GEO數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)。這套表達譜數(shù)據(jù)集合包含110例冠心病病人和112例健康正常人(其中2例由于數(shù)據(jù)質(zhì)量較低被刪除)。杜克大學(xué)的冠狀動脈疾病指數(shù)(CADi)〔7，8〕被用來標(biāo)示病人特征。使用GPL96平臺:〔HG-U133A〕Affymetrix Human Genome U133A Array。

1.3 基因選擇 數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)化和質(zhì)量控制過程使用RMA方法〔9〕完成。首先，背景噪聲和人工痕跡誤差通過使用基于模型的背景校正來中和;第二，所有的探針表達值通過使用分位數(shù)歸一化對齊到公共比例，最后，通過迭代生成每個探針表達值中位數(shù)平滑過程。然后所得到表達值使用LOG2進行轉(zhuǎn)化用于隨后的分析。

1.4 網(wǎng)絡(luò)分析 蛋白質(zhì)相互作用(PPI)是生物過程中非常重要的一種〔10〕。網(wǎng)絡(luò)中擁有更多相互作用蛋白的蛋白通常被認為有更為重要的功能。網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建和圖形化展示過程使用Cytoscape(V2.8.3，available on http://www.cytoscape.org/)〔11〕和美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫(http://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/gene/GeneRIF/，2013-2-25)完成。蛋白質(zhì)擁有的相互作用的蛋白質(zhì)數(shù)目即為degree。Degree數(shù)目大于10被認為是網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵蛋白。

1.5 TargetScan TargetScan是基于 miRNAs與靶基因3＇UTR序列的結(jié)合機制，對miRNA靶基因進行預(yù)測的軟件。

1.6 試劑 Trizol提取RNA試劑盒、SYBR Green試劑均購自Invitrogen公司。

1.7 RT-PCR檢測mRNA表達量 按照Trizol試劑盒說明書提取樣本總 RNA，-80℃凍存。引物序列由 Invitrogen公司合成。反轉(zhuǎn)錄合成cDNA后，使用實時PCR定量檢測mRNA表達量。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS13.0軟件進行t檢驗和線性相關(guān)性分析。

2 結(jié)果

2.1 ESR1是冠心病中的重要樞紐基因(HUB gene)PLS分析表明，1 246個基因被認為是候選基因(FDR＜0.05)。為了避免模型過擬合，潛變量的最佳數(shù)量由基于均方根交叉驗證(RMSECV)的均方誤差的4-fold交叉驗證確定。結(jié)果表明，RMSECV隨著潛變量數(shù)的增加呈下降趨勢，但這一趨勢在數(shù)值超過8之后放緩。因此，前8名潛變量被用于進一步的分析。然后計算了每個候選基因的回歸系數(shù)的可靠性，閾值(這里是1.434)是根據(jù)RMSECV的最低值而厘定。最后，一共有390個基因被選擇作為CAD的差異表達基因。圖1展示了差異表達基因表達產(chǎn)物的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，可見ESR1是其中的關(guān)鍵基因。

2.2 對 ESR1 3＇UTR分析預(yù)測調(diào)控 micro RNA miR-18ab/4735-3p和miR-22/22-3p的匹配度和保守度最高。見圖2。選擇miR-18a及miR-22作為進一步的研究對象。

2.3 ESR1在CAD中高表達與miR-18a、miR-22的相關(guān)性分析與對照組(1.105±0.193)相比，ESR1在CAD組(4.858±2.296)呈高表達(P＜0.001)，CAD組miR-18a表達量(0.506±0.273)較對照組(1.082±0.031)低(P＜0.001)，而 CAD組(0.930±0.470)和對照組miR-22的表達量(1.131±0.142)并無顯著差異(P＞0.05)。

miR-18a高表達的組織中ESR1的表達相對較低，miR-22水平和ESR1水平并無明顯的相關(guān)性(r=0.117 9，P=0.341 3)，而miR-18a的表達與ESR1表達量之間呈負相關(guān)關(guān)系(r=－0.781 5，P=0.003 1)。見圖 3。

圖1 差異化表達基因蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

圖2 TargetScan對ESR1 3＇UTR分析結(jié)果

圖3 ESR1、miR-18a、miR-22在CAD樣本中表達的相關(guān)性

3 討論

CAD發(fā)病是一個多基因參與復(fù)雜過程，而其中又有很多的miRNA參與調(diào)節(jié)。曾有許多研究從不同角度來闡述。Jin〔12〕發(fā)現(xiàn)miR-214能夠抑制血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的表達和生理功能，沉默miR-214不僅恢復(fù)了VEGF表達水平與病變內(nèi)皮祖細胞的體外血管生成，也進一步促進了小鼠缺血肢體的血流量恢復(fù)，miR-214通過調(diào)控VEGF來影響CAD的發(fā)病過程。Han等〔13〕發(fā)現(xiàn) miR-34a，miR-21 miR-23a在 CAD 患者中升高，這意味著這些miRNAs可以作為CAD的發(fā)展和進展的生物標(biāo)志物。遺傳易感性是其中的重要因素，然而目前對CAD致病基因及其作用機制雖然提出了很多理論，但仍然沒有定論。對于數(shù)據(jù)的分析來說，處理基因數(shù)目較大和樣本量相對較小的情況時候，一個合適的模型就顯得非常重要的。以往CAD基因表達的研究大多采用方差/回歸分析，不考慮隱藏的生物學(xué)效應(yīng)。本文使用整合了Monte Carlo技術(shù)的PLS方法，以確定CAD差異表達基因〔14〕。本文表明，ESR1是相互作用程度最高的關(guān)鍵節(jié)點蛋白。ESR1基因多態(tài)性與CAD在不同人群相關(guān)聯(lián)。

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