人退變腰椎間盤特異性表達microRNA的靶基因及JNK信號轉導通路在椎間盤退變中的分子生物學機制

王明遠 宋西正 李國棟 (青海省人民醫院，青海 西寧 810001)

腰椎間盤退變(IVDD)為腰背疼痛的主要原因之一，多數研究者認為營養、遺傳、力學、免疫等多種因素共同作用導致該病的發生〔1〕。其中力學因素的作用最為直接，主要由于人類的直立行走。同時在行走過程中，椎間盤易受到損傷，當髓核物質暴露于體液環境中，會激活機體中自身免疫反應和炎性因子，將退變信號傳至細胞核，影響核內基因表達，影響椎間盤中關鍵組分的合成和降解〔2〕。因此，研究者希望通過對信號傳導通路進行有效干預來減緩IVDD的病情發展〔3〕。但目前對于IVDD相關基因和調控退變信號傳導的通路仍未明確，嚴重影響到IVDD的細胞生物學治療進展。本研究通過篩選退變腰椎間盤中的特異性表達microRNA的靶基因，旨在探討JNK信號傳導通路在IVDD中的分子生物學機制。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取腰椎退行性疾病患者10例為研究組，術中均切除退變髓核組織塊。排除合并腫瘤、類風濕關節炎、感染性疾病者;近3個月內接受免疫制劑治療者;其中男7例，女3例，年齡58～71歲，L4～5間盤4例、L5～S1間盤6例，突出型5例、疝出型5例;其中5例用于篩選實驗，5例用于驗證實驗。選取腰椎爆裂性骨折接受前路減壓髓核切除術患者4例為對照組，術中均切除正常髓核組織塊。腰椎間盤影像學檢查均未顯示出退變改變，年齡均＜25歲;其中男3例，女1例，年齡18～24歲，均為L1～2間盤組織;其中2例用于篩選實驗，2例用于驗證實驗。

1.2 儀器與試劑 熒光定量PCR檢測儀(瑞士羅氏公司，LightCycler 480型);雙光子熒光顯微鏡(德國Lavision Biotec公司);倒置顯微鏡(日本尼康公司，TE2000-U型);全自動酶標儀(瑞士 TECAN公司，GENIOS M200型);CO2培養箱(美國SHEL LAB公司，2406型)。DMEM培養基(上海卡邁舒科技實業有限公司);胎牛血清(濰坊瑞華生物科技有限公司);EDTA、胰蛋白酶(美國Sigma公司);Trizol試劑(上海科敏生物科技有限公司);RNA保存液(上海逍鵬生物科技有限公司);microRNA qPCR引物、試劑盒(美國Signosis公司)。

1.3 microRNA篩選方法

1.3.1 髓核細胞分離、培養、鑒定 分別采用含青霉素和無青霉素的D-Hanks溶液將髓核組織各沖洗3遍;將髓核組織用剪刀剪碎后使用0.25%的胰蛋白酶和0.2%的Ⅱ型膠原酶在37℃條件下聯合消化1 h，每5 min輕搖1次，2 000 r/min離心5 min，棄去上清液。使用DMEM培養液將細胞吹勻，再次離心，重復3次。細胞計數后按1×106接種在培養瓶中，加入10 ml含青霉素100 U/ml、10%胎牛血清的DMEM培養液中。放入5%的CO2、37℃的細胞培養箱中，每2～3 d換1次培養液，并進行傳代。當第1代細胞爬片到80%融合時，取出并進行瑞氏染色、Ⅱ型膠原免疫細胞化學染色等，置于關鏡下對細胞進行觀察。

1.3.2 數據校正及差異探針篩選 先預處理使用microRNA微陣列芯片方法獲得的篩選結果，將實驗中存在的隨機誤差對數據分析帶來的影響消除;校正后的信號值采用穩定多列陣分析(RMA)歸一化法獲得。

1.3.3 統計學方法 采用聚類分析軟件Cluster3.0以及RAM對差異表達的基因進行篩選。計算得到兩樣本間校正之后的熒光強度比值;將2作為閾值篩選差異microRNA，其中比值＜0.5為下調microRNA，＞2為上調microRNA。

1.4 顯著性高表達microRNA的驗證方法 將進行驗證實驗的7例標本處理后進行標記，其中對照組2例正常標本標記為1～2號，研究組5例標本標記為3～7號。將標記好的樣本放于4℃冰箱中保存過夜，之后取出2 000 r/min離心10 min，棄去保存液后置于－80℃冰箱中保存。依次進行總RNA提取和microRNA反轉錄反應，采用無菌蒸餾水將得到的反轉錄產物稀釋5倍后進行下游實時qPCR實驗。采用染料法進行相對定量PCR分析，重復進行3次，結果取平均值。

2 結果

2.1 髓核細胞鑒定 瑞氏染色后顯示細胞核呈藍色，細胞質呈淡紫色，形態良好且邊緣清晰;甲苯胺藍染色后顯示細胞核呈陽性，細胞質淡染，提示能夠合成糖胺多糖;番紅O染色顯示細胞核較小，細胞質淡染，分散分布;Ⅱ型膠原免疫組化染色顯示細胞呈棕色，細胞核呈藍紫色，見圖1。

圖1 髓核細胞鑒定(×200)

2.2 差異性表達的microRNA 微陣列的基因表達數據分析與篩選顯示，研究組和對照組比值＞2的上調microRNA共包含20種，其中microRNA.494和microRNA.513a.5p表現為明顯高表達，比值分別為2.835 1、2.115 7。

2.3 聚類分析和靶基因預測 對差異性表達的microRNA行聚類分析，結果顯示，microRNA.494和microRNA.513a.5p在1號對照組中表達水平較低，在3號和4號研究組中表達水平較高，在2號研究組中表達水平中等。采用Targetscan6.2軟件進行靶基因預測顯示，人退變髓核細胞中microRNA.494和microRNA.513a.5p均為高表達，預測靶基因分別為MKK4、JunD。

2.4 靶基因GO和信號傳導通路分析 將差異性表達的靶基因進行GO分析顯示，研究組相比于對照組上調的靶基因在相關生物學過程中有9個最明顯的GO term富集度;對差異基因、靶基因進行信號傳導通路分析顯示，MKK4和JunD均參與了JNK信號通路，且分別處于JNK信號通路的上游和下游。

2.5 microRNA.494和microRNA.513a.5p驗證和表達量 不同樣品中的PCR擴增和溶解曲線microRNA.494和microRNA.513a.5p均顯示為單峰，且產物具有特異性，無產物二聚體生成。將對照組中1號正常標本為對照檢測Ct值，并采用2-△△Ct法計算差異倍數，其中對照組中兩例標本之間差異無明顯變化，2-△△Ct分別為0.89、3.24。研究組5例標本與對照組中標本1相比差異均表現為高倍數表達，2-△△Ct均值在 microRNA.494中為 12.445 0±8.042 0，在 microRNA.513a.5p中為48.477 0±37.163 6。

3 討論

microRNA通過DNA轉錄形成，但無法翻譯為蛋白質，在蛋白質合成過程中對其他基因的功能進行調節〔4〕。因此，在其他蛋白質編碼基因的產生方面microRNA具有重要的調控作用。當炎性因子經細胞膜上的受體將細胞中的信號傳導通道激活后，使細胞核中的基因表達情況發生改變，加速了椎間盤中的蛋白多糖及膠原等重要成分的降解，同時抑制了以上成分的合成，進而導致椎間盤中的水分喪失〔5〕。因此，基因治療需要在明確介導細胞中基因表達變化的信號傳導通路的基礎上才能取得理想的效果。

本研究提示，JNK信號通路在腰椎間盤退變的病情進展中起到關鍵作用，且受到microRNA.494和microRNA.513a.5p的調控。相關研究也顯示，以上兩種microRNA在人體細胞的老化過程中有著明顯的調節作用〔6〕。

JNK信號傳導途徑在細胞的應激反應過程中發揮關鍵作用，且能夠被多種細胞外應激信號激活。除應激反應之外，該信號通路還能被白細胞介素(IL)-1、生長因子激活〔7〕。JNK蛋白激酶中存在3個編碼基因，分別為JNK1～3。其中JNK1、JNK2基因在全身范圍內均有表達，在病理過程中起到重要作用，特別是免疫系統;JNK3僅表達于心臟、腦、睪丸，在神經系統中發揮作用，特別是神經細胞凋亡〔8〕。

MKK4為MAPK信號通路的重要成分，可激活JNK通路起到誘導細胞凋亡、限制腫瘤細胞生長的效果。JunD能夠被JNK通路激活，起到防止細胞凋亡的效果。microRNA.513a.5p能夠通過激活MKK4來正向調節JNK通路;microRNA.494通過激活JunD來負向調節JNK通路。以上可能為人類機體的一種自我保護機制，在退變間盤中同時存在有凋亡和抗凋亡兩種機制，形成一種動態平衡，使得退變無法在短時間內完成。

1 李 翔，李新志.腰椎間盤退變基因治療的研究進展〔J〕.中國全科醫學，2013;16(33):3895-7.

2 葉 偉.炎性因子在腰椎間盤退變機制中的作用〔D〕.中山:中山大學博士學位論文，2006.

3 馬秀才，沈 霖.腰椎間盤退變分子生物學因素研究進展〔J〕.中國矯形外科雜志，2011;19(17):1451-3.

4 耿 翔，呂國華.聚集蛋白聚糖基因多態性與腰椎間盤退變相關性的研究進展〔J〕.中國脊柱脊髓雜志，2013;23(4):370-2.

5 孫正明，劉 淼，張銀剛，等.腰椎間盤退變相關基因的研究〔J〕.中華骨科雜志，2008;28(6):516-9.

6 陳文杰，王洪立，姜建元，等.微生物學因素在椎間盤退變中的研究進展〔J〕.中華骨科雜志，2014;34(8):872-4.

7 劉 浩.環境因素和ADAMTS-4多態性與腰椎間盤退行性疾病相關研究〔D〕.北京:北京協和醫學院(中國醫學科學院)博士學位論文，2011.

8 丁文元，曹來震，申 勇，等.退變性腰椎側凸形成和發展的相關因素分析〔J〕.中華外科雜志，2011;49(5):404-8.