熒光素酶標記人肝癌細胞的動物模型的建立

李海濱孫煦勇秦 科鄧添薪趙國志黃程新覃音紅楊 柳

（1.中國人民解放軍第三〇三醫院移植醫學研究院，廣西移植醫學重點實驗室，廣州軍區器官移植中心，廣西 南寧 530021；2.廣西醫科大學第一附屬醫院，廣西 南寧 530021；3.廣西醫科大學，廣西 南寧 530021）

熒光素酶標記人肝癌細胞的動物模型的建立

李海濱1孫煦勇1秦 科1鄧添薪2趙國志3黃程新1覃音紅1楊 柳1

（1.中國人民解放軍第三〇三醫院移植醫學研究院，廣西移植醫學重點實驗室，廣州軍區器官移植中心，廣西 南寧 530021；2.廣西醫科大學第一附屬醫院，廣西 南寧 530021；3.廣西醫科大學，廣西 南寧 530021）

目的：利用熒光素酶基因標記的人肝癌細胞株HEPG2建立裸鼠肝原位移植動物模型。方法：裸鼠肝門靜脈接種1×106個細胞使其成瘤，經活體熒光成像觀察腫瘤的生長情況。結果：利用熒光索酶基因標記的人肝癌細胞HEPG2，成功建立了原位肝癌裸鼠模型。結論：利用熒光索酶基因標記的人肝癌細胞HEPG2，可建立了原位肝癌裸鼠模型。小動物活體成像可為原位腫瘤模型的建立提供了一種新的可靠的技術，為進一步研究肝癌生長轉移機制和藥物開發提供了新的有用工具。

熒光素酶；肝癌；動物模型

生物發光成像是目前常用的活體成像技術之一，與其他影像學技術相比，熒光素酶發光的特點是在哺乳動物組織和細胞中的背景非常低小，細胞自身的內源性光較低，穿透力強，具有更高的靈敏度，生物發光技術成像因其操作極其簡單、所得結果直觀、靈敏度高，活體可在不同時間點觀察，從而減少實驗動物數量，目前已廣泛應用于生命科學、醫學及藥物研究等領域[1,2]。本移植中心每年完成 30～50例肝移植患者中多數為肝癌患者，為更好地監測轉染了抗癌基因的細胞植入體內的動向及效果，給予患者有效的治療，本研究利用表達了熒光素酶的肝癌細胞株HEPG2建立了裸鼠肝原位移植動物模型。利用生物發光成像技術對此模型內的腫瘤生長進行非侵入性的連續監測，同時評價生物發光成像在裸鼠肝原位移植模型建立中的作用，為肝癌生長轉移機制的研究和藥物開發以及細胞治療提供有效手段。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1試劑與儀器

人肝癌細胞HEPG2由加拿大UBC大學戴龍君教授惠贈，L-谷氨酰胺(GIBICO公司)，雙抗(GIBICO公司)，DMEM (GIBICO公司)，胎牛血清（Hyclone公司），熒光素酶底物（Luciferin，Caliper Life Sciences），活體動物熒光成像系統（Lumazone，美國），二氧化碳培養箱（Thermo）。

1.1.2實驗動物

BALB/C裸鼠購自廣西醫科大學實驗動物中心（實驗動物使用許可證SYXK桂2014-0003），鼠齡6周，體重18～21g，飼養在SPF飼養間。所有實驗動物的使用與實驗操作程序均經廣西醫科大學與解放軍第三〇三醫院實驗動物使用管理委員會批準和實驗動物福利和倫理委員會的許可。

1.2方法

1.2.1細胞培養

采用DMEM作為基礎培養液，配成含10% 胎牛血清、100IU/ml 雙抗的培養液，同時設置兩孔標記了熒光素酶的細胞與兩孔未標記的細胞于96孔板，置于5%CO2、37℃細胞培養箱內培養。

1.2.2裸鼠肝癌原位移植模型的建立和活體熒光觀察

收集處于生長對數期的轉染細胞，稀釋至2×106cells/ml，取250μl細胞懸液進行肝門靜脈接種，共接種3只。每隔一周觀察一次，連續觀察四周，觀察前每只裸鼠腹腔注射熒光素底物(1μl/g)，戊巴比妥鈉(0．1 ml/g)麻醉后平放于活體熒光影像系統攝像，同時將在96孔板中培養的細胞分別加入熒光素底物后拍照，并用儀器自身所帶圖像分析軟件進行分析。

2 結果

2.1細胞培養

細胞在本實驗條件下生長良好，細胞呈梭形或多邊形，飽滿，貼壁生長（如圖1）。

圖1　HEPG2細胞

2.2裸鼠肝癌原位移植模型的建立和活體熒光觀察

手術注射人肝癌細胞HEPG2后一周，2只小鼠死亡，成活1只。將余下1只小鼠麻醉后平放于活體熒光影像系統攝像，發現裸鼠肝臟出現米粒大小的腫瘤病灶，后面幾次略有增大。培養的細胞中加入熒光素底物后拍照可見細胞出現熒光（如圖2）。

圖2　肝癌原位移植模型與細胞的熒光觀察

3 討論

報告基因(reporter gene)是一組編碼易被檢測的蛋白質或酶的基因，在調控序列控制下進行表達，其與目的基因融合后的表達產物可用來標定目的基因的表達調控[3-5]。生物發光成像是目前常用的活體成像技術之一，與其他影像學技術相比，熒光素酶發光的特點是在哺乳動物組織和細胞中的背景非常低小，細胞自身的內源性光較低，穿透力強，具有更高的靈敏度，生物發光技術成像因其操作極其簡單、所得結果直觀、靈敏度高，活體可在不同時間點觀察，從而減少實驗動物數量，目前已廣泛應用于生命科學、醫學及藥物研究等領域。活體成像技術是目前廣泛用于腫瘤轉移、基因治療、干細胞示蹤、白血病等相關領域的研究，因此利用Luciferase標記的腫瘤細胞進行小動物活體成像能夠更有效地觀察腫瘤的發生、發展過程及評價治療效果[6,7]。

小動物成像技術對能檢測的腫瘤動物模型微小病灶的檢測靈敏度極高，能夠無創、實時、動態的動物活體觀察，從而對同一對象進行不同時間點的觀察，減少實驗動物個體間差異，與傳統的方法相比，可大大減少實驗動物的用量，同時符合替代、減少、優化的“3R”原則，已成為廣泛應用于醫學、生物學及藥物開發等研究領域[8]。

本實驗利用熒光素酶基因標記人肝癌細胞HEPG2，獲得穩定表達熒光素酶基因的細胞克隆，經過多次傳代表達水平穩定，標記細胞的形態、生長方式、生長速度及致瘤能力等與未轉染細胞無明顯差異，可以反映HEPG2腫瘤細胞生物學行為的標記細胞。將其經肝門靜脈接種裸鼠，用活體熒光成像系統連續觀察，發現能夠成瘤，并且腫瘤的體積與發光強度有相關性。手術時需注意不要將細胞漏到注射部位外，否則容易對成瘤的成像觀察造成影響。動態觀察4～6周后，可將成瘤動物安樂死，獲取病變組織，按病理程序嚴格操作留樣，相關研究結果將后續報道。

綜上所述，利用熒光素酶基因標記的人肝癌細胞HEPG2成功建立了原位肝癌裸鼠模型，小動物活體成像為原位腫瘤模型的建立提供了一種新的可靠的技術，可為進一步研究肝癌生長轉移機制和藥物開發以及細胞治療提供有效技術手段。

致謝

本研究得到了加拿大UBC大學的戴龍君教授的大力幫助，并無私贈送了HEP2細胞，在此表示感謝。

[1] 王一帆,夏睿,郭玉林,等.腺病毒介導熒光素酶報告基因感染間充質干細胞的研究[J].中華核醫學與分子影像雜志, 2013,33(6):473-477.

[2] 董苑,李彩霞,趙嫻,等.熒光素酶基因穩定表達的間充質干細胞系的構建[J].中華顯微外科雜志,2014,(6): 569-572.

[3] 薛秀花,黃晨西.熒光素酶基因的研究進展[J].生物學通報,2013,48(9):1-4.

[4] 張禾璇,單可人,官志忠.報告基因研究及其應用進展[J].國際遺傳學雜志,2013,36(1):6-12.

[5] Maita H,Tomita K,Ariga H. A split luciferase-based reporter for detection of a cellular macromolecular complex[J].Anal Biochem,2014,(452):1-9.

[6] 張金棟,呂景禮,李曉艷,等.整合熒光素酶的穩定細胞克隆建立裸鼠肺癌靜脈移植瘤模型的探索[J].實用醫學雜志,2012,28(7):1055-1057.

[7] Lake M C,Aboagye E O.Luciferase fragment complementtation imaging in preclinical cancer studies[J].Oncoscience, 2014, 1(5):310-325.

[8] 李小穎,高凱,董偉,等.熒光素酶標的人肝癌細胞裸鼠異種移植瘤模型的生物發光成像和PET-CT成像比較[J].中國比較醫學雜志,2011,(3):10-13.

Establishment of the animal model with human hepatoma cell labelled with luciferase

Objective:To establish hepatic carcinoma mouse model with human HEPG2 cells expressing luciferase. Methods:1×106cells which constitutively expressing lueiferase were inoculated to liver of BALB／c-nu through hepatic portal vein for assessment of tumor growth with the whole-body optical imaging system.Results:Successfully establish hepatic carcinoma mouse model with human HEPG2 cells expressing luciferase.Conclusion:Hepatic carcinoma mouse model with human HEPG2 cells expressing luciferase can be successfully made,which is a new tool to further study the mechanism of metastasis and drug discovery.

Luciferase;hepatoma;animal model

R392.4

A

1008-1151(2015)06-0102-02

2015-05-12

廣西自然基金（2013gxnsfaa019253）；廣西科學技術開發與研究項目（桂科攻14124003-8）。

李海濱，男，中國人民解放軍第三〇三醫院移植醫學研究院實驗師，從事轉基因與克隆、分子生物學、移植免疫學研究。

孫煦勇，中國人民解放軍第三〇三醫院移植醫學研究院，廣西移植醫學重點實驗室主任醫師，博士，碩士生導師。