線粒體旁路氧化途徑抑制劑水楊肟酸(SHAM)協同下煙草赤星病菌對嘧菌酯的敏感性

黃艷飛，陳慶園，王進，薛娟娟，王茂勝，魯紅學，商勝華，張長青，汪漢成

1長江大學 農學院，湖北 荊州 434025;

2貴州省煙草科學研究院，煙草行業分子遺傳重點實驗室，貴陽 550081;

3長江大學 生命科學學院，湖北 荊州 434025

線粒體旁路氧化途徑抑制劑水楊肟酸(SHAM)協同下煙草赤星病菌對嘧菌酯的敏感性

黃艷飛1，陳慶園2，王進3，薛娟娟1，王茂勝2，魯紅學1，商勝華2，張長青1，汪漢成2

1長江大學 農學院，湖北 荊州 434025;

2貴州省煙草科學研究院，煙草行業分子遺傳重點實驗室，貴陽 550081;

3長江大學 生命科學學院，湖北 荊州 434025

測定了線粒體旁路氧化途徑抑制劑水楊肟酸(SHAM)協同下煙草赤星病菌對嘧菌酯的敏感性。結果表明：嘧菌酯抑制病原菌菌絲生長和孢子萌發的EC50值分別為25.8300 mg/L和0.0500 mg/L，在100 mg/L SHAM協同下，EC50值分別降低為15.5200和0.0038 mg/L；SHAM對煙草赤星病菌菌絲的生長和分生孢子的萌發沒有影響。研究說明SHAM增強了嘧菌酯對煙草赤星病菌的毒力，線粒體電子傳遞的旁路氧化途徑存在于煙草赤星病菌中，且在孢子萌發中的增效強于菌絲生長階段。

煙草赤星病菌；嘧菌酯；水楊肟酸 ；敏感性

由 Alternaria alternata（Frises）Keissler引 起 的煙草赤星病（tobacco brown spot）是煙草生長中后期發生最為嚴重的葉部病害[1-5]，導致煙葉品質下降，烘烤價值降低[6-8]。化學防治是目前該病害防治上最為普遍的防治措施。然而，長期大量的使用殺菌劑，導致了病原菌抗藥性問題日趨嚴重[9-13]。

甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑是一種新型、高效、廣譜、內吸性的殺菌劑，可抑制幾乎所有的真菌界病菌孢子的萌發及產生，控制菌絲體的生長和病原孢子的侵入[14-16]。嘧菌酯是這類殺菌劑中典型的代表，具有全新的生化作用機制，主要作用于真菌的線粒體，與線粒體上細胞色素b（cyt b）的Qo位點相結合，阻斷細胞色素b和細胞色素c1之間的電子傳遞，破壞能量合成，從而抑制真菌生長或殺死真菌[17-20]。近些年來，甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑(QoI類)在全球許多國家被登記用來防治鏈格孢屬真菌性病害，其中最為廣泛的為嘧菌酯[16,21]。由于真菌體內的產能代謝不止線粒體呼吸作用一條，還包括真菌在呼吸作用受抑制的情況下，誘導啟動的旁路氧化途徑[22]。旁路氧化途徑的補償作用是導致部分病原真菌對QoIs類殺菌劑不敏感或敏感性下降的重要原因之一[23-26]。旁路氧化途徑被報道存在于辣椒炭疽病菌（Colletotrichum capsici）、黃瓜灰霉病菌（Botrytis cinerea）、水稻紋枯病菌（Rhizoctonia solani）和水稻稻瘟病菌（Magnaporthe grisea）中[23,27]；該途徑是否存在于煙草赤星病菌中目前還不清楚。

水楊肟酸是調節旁路氧化途徑中旁路氧化酶的專性抑制劑，作用于旁路氧化酶，使其失活，從而專一地抑制旁路氧化作用的產能[28]。本文旨在研究煙草赤星病菌旁路氧化途徑被抑制前后，煙草赤星病菌對嘧菌酯的生物活性，以期為嘧菌酯防治煙草赤星病提供參考。

1 材料與方法

1.1 病原菌、培養基及供試藥劑

供試煙草赤星病菌菌株C2由貴州省煙草科學研究院真菌實驗室分離、鑒定和提供，為敏感菌株。馬鈴薯培養基（PDA）：土豆200 g煮沸20min后過濾，濾液添加20 g瓊脂和20 g葡萄糖煮沸，定容至1 L，滅菌，用于病原真菌的敏感性測定。相同階段敏感性測定，所有藥劑均采用同一批培養基以減少試驗誤差。

對照藥劑95.3%氟硅唑、96%醚菌酯、95%苯醚甲環唑原藥分別由南通柯林化學品有限公司、鹽城福利德化工有限公司和江蘇揚農化工集團有限公司提供。將上述藥劑溶于甲醇，分別配成10000 mg/L的母液。對照藥劑96%多菌靈由江蘇藍豐生物化工股份有限公司生產，將其溶于0.2M的稀鹽酸配成10000 mg L-1的母液。對照藥劑97.3%異菌脲由泰安圣聚華有限公司生產，將該藥劑溶于丙酮配成10000 mg/L的母液。用無菌水將上述母液稀釋成系列濃度的藥液，于4 ℃黑暗條件下保存、備用。96.8%嘧菌酯由先正達(中國)投資有限公司提供，溶于甲醇，配成10000 mg/L的母液。99%水楊肟酸（salicyhydroxamic acid， SHAM）美國Acros Organics公司生產，溶于甲醇配置成1.0×105mg/L的母液，4℃保存備用。試驗時將上述系列濃度的藥液加至50℃左右的PDA培養基中制備含藥平板，其中甲醇、丙酮、稀鹽酸的含量小于待測溶液體積的0.25%，此濃度的甲醇、丙酮、稀鹽酸不影響煙草赤星病菌菌絲的生長和孢子的萌發(數據略)。無菌水中加入相同體積的甲醇、丙酮或稀鹽酸處理作為空白對照。

1.2 煙草赤星病菌對6種殺菌劑的敏感性

采用“菌絲生長速率”法，將供試煙草赤星病菌菌株移至PDA培養基上，于28℃、黑暗條件下預培養5 d，用5mm孔徑打孔器在菌落邊緣打制菌碟。將制好的菌碟置于9 cm直徑的含系列濃度藥劑的PDA平板上。嘧菌酯和醚菌酯的最終供試濃度為（0、3.13、6.25、12.50、25、50、100） mg /L。多菌靈、氟硅唑、異菌脲、苯醚甲環唑的最終供試濃度為（0、0.16、0.31、0.63、1.25、2.50、5、10 ）mg/ L。各藥劑處理均重復3次。接菌后，28℃黑暗條件下培養6 d，用“十字交叉法”測量各菌落直徑，并計算各藥劑處理對煙草赤星病菌菌絲生長的抑制率。菌落增長直徑=菌落直徑-菌碟直徑

1.3 水楊肟酸協同下煙草赤星病菌對嘧菌酯的敏感性

參照上述方法在PDA培養基上進行測定。配制含100 mg/L水楊肟酸的待測藥劑系列濃度的PDA平板。將制好的菌碟置于PDA平板上。嘧菌酯的最終供試濃度為0、3.13、6.25、12.50、25、50、100 mg/L。所有處理均重復3次。在28℃黑暗條件下培養6 d，用“十字交叉法”量取菌落直徑。

參考袁善奎等的方法[29]，將煙草赤星病菌在PDA培養基上28 ℃黑暗培養7 d，用打孔器(5mm)在菌落邊緣制取菌碟，挑出5塊菌碟，將其分散于含有500 μL系列濃度嘧菌酯的1 mL離心管中，以含有相同體積無菌水的離心管為對照，渦旋后獲得含不同濃度藥劑的孢子懸浮液。嘧菌酯的最終供試濃度為（0、0.03、0.05、0.10、0.20、0.40） mg/L。協同作用下所有處理中水楊肟酸的濃度均為100 mg/L。取上述含藥孢子懸浮液各20 μL于載破片上，將載玻片置于一次性培養皿中，保濕，各濃度藥劑處理均重復3次。28℃黑暗培養10 h，在顯微鏡下（10 × 10倍）鏡檢孢子萌發的數量，每個玻片隨機挑選3個視野，3次重復。當萌發芽管的長度超過孢子長度一半時，視為萌發。

1.4 數據處理

綜合試驗數據，用Excel軟件進行統計分析。以藥劑的濃度對數為橫坐標，以對病菌所測對象抑制率的幾率值為縱坐標，建立線形回歸方程，并進行相關性分析（r）[30]。根據方程計算各種藥劑抑制菌絲生長、孢子萌發的EC50和EC90值。最后根據EC50值，分析比較不同殺菌劑對煙草赤星病菌的毒力。

2 結果與分析

2.1 煙草赤星病菌對6種殺菌劑的敏感性

結果表明，苯醚甲環唑和氟硅唑對煙草赤星病菌的菌絲生長毒力最強，其EC50值和EC90值分別為0.3000 mg/L、0.3300 mg/L和 10.6700 mg/L、3.4600 mg/L；其次為異菌脲及嘧菌酯，其EC50值和EC90值分別為2.1500 mg/L、25.8300 mg/L和 7.9700 mg/L、＞ 100 mg/L，醚菌酯和多菌靈的毒力較弱，其EC50值均＞100 mg/L（表1）。空白對照處理黑暗條件下培養6d后煙草赤星病菌的菌落直徑為67mm。

表1 煙草赤星病菌對6種殺菌劑的敏感性Tab. 1 Sensitivity of Alternaria alternata to six fungicides

2.2 水楊肟酸協同下煙草赤星病菌對嘧菌酯的敏感性

結果表明，嘧菌酯對煙草赤星病菌孢子的萌發和菌絲的生長均有抑制作用，其中對孢子萌發的毒力較強。隨著藥劑濃度的增加，對分生孢子的萌發和菌絲的生長抑制逐漸增強（圖1、3），其EC50和EC90值分別為0.0500和0.3200 mg/L，25.8300和＞100 mg/L（表2）。嘧菌酯低劑量處理時，煙草赤星病菌分生孢子萌發芽管顯著畸形（圖3）。空白對照分子孢子萌發率為90%。

100 mg/L水楊肟酸作用下，煙草赤星病菌分生孢子具有同空白對照處理一樣的孢子萌發率（90%）和菌絲生長速率（65.50mm），水楊肟酸對赤星病菌孢子的萌發（圖3A、4A）和菌絲生長無抑制作用圖（2A、2B）。

100 mg/L水楊肟酸協同作用下，嘧菌酯對煙草赤星病菌孢子萌發和菌絲生長的毒力均顯著增強（圖2、4），其EC50和EC90值分別為0.0038和0.1200 mg/L，15.5200和100 mg/L（表2）。

表2 嘧菌酯及其與水楊肟酸協同作用下對煙草赤星病菌菌絲生長和孢子萌發的毒力Tab. 2 Toxicity of azoxystrobin and its synergistic effect with salicylhydroxamic acid against mycelial growth and conidial germination of Alternaria alternata

圖1 嘧菌酯對煙草赤星病菌菌絲生長的影響Fig. 1 Effect of azoxystrobin on mycelial growth of Alternaria alternata (A to G were 0, 3.13, 6.25, 12.50, 25, 50, 100 mg/L azoxystrobin, respectively.)

圖2 水楊肟酸100 mg/L協同下嘧菌酯對煙草赤星病菌菌絲生長的影響Fig.2 Effect of azoxystrobin on mycelial growth of Alternaria alternata in combination of 100 mg/L SHAM (A was water treatment; B to H were 0, 3.13, 6.25, 12.50, 25, 50, 100 mg/L azoxystrobin, respectively.)

圖3 嘧菌酯對煙草赤星病菌孢子萌發的影響 (100倍)Fig.3 Effect of conidial germination of Alternaria alternata under various pressures of azoxystrobin (A to F were 0, 0.025, 0.05, 0.10, 0.20 and 0.40 mg/L azoxystrobin, respectively.)

圖4 水楊肟酸100 mg/L協同下嘧菌酯對煙草赤星病菌分生孢子萌發的影響（100倍）Fig.4 Effect of azoxystrobin on conidial germination of Alternaria alternata in combination of 100 mg/L SHAM (A to F were 0,0.025, 0.05, 0.10, 0.20 and 0.40 mg/L azoxystrobin, respectively.)

3 討論

在SHAM的作用下，嘧菌酯對煙草赤星病菌的毒力增強（對菌絲生長和孢子萌發毒力分別提高1.66和14倍），進一步證實了煙草赤星病菌的菌絲生長和孢子萌發過程中均存在旁路呼吸作用。旁路呼吸作用能削弱嘧菌酯對煙草赤星病菌的生物活性；但煙草赤星病菌孢子萌發和菌絲生長階段，該呼吸途徑在電子傳遞上的貢獻存在差異，差異的大小可能與孢子萌發階段病原菌需要大量的能量（ATP），而其菌絲生長階段需要ATP的量較少有關[27]。

本文所測定的藥劑中，多菌靈對煙草赤星病菌的生物活性較低；苯醚甲環唑、異菌脲及氟硅唑對煙草赤星病菌菌絲的生長均表現出強烈的抑制作用，測定結果與嚴清平等的報道一致[31]，也與其他類鏈格孢屬病原菌對上述藥劑的敏感性相似[31-33]，但由于三唑類藥劑對作物易產生藥害、且殘留較高等方面的原因[34-35]，尚未在煙草上正式登記。而赤星病菌已經對異菌脲產生廣泛的抗藥性[36]。所以上述藥劑均不宜用于煙草赤星病的防治。

甲氧基丙烯酸酯類的嘧菌酯和醚菌酯對赤星病菌孢子萌發和菌絲生長均有一定的生物活性，因此，它們對赤星病的防治可能同時表現出保護和治療活性。由于嘧菌酯對孢子萌發的毒力（EC50值0.0540 mg/L）高于菌絲生長的毒力（EC50值25.8300 mg/L），因此，在煙草上它的保護作用（病菌侵染前對孢子的抑制）可能優于治療作用（病菌侵染后對菌絲的抑制），但如何用于煙草赤星病的防治，其防治技術有待深入研究，如嘧菌酯的最宜使用劑量、使用次數、使用間隔期、藥劑在煙草上的內吸性與傳導活性、殘留與持效期等。

此外，由于甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑作用靶標單一，國內外長期高濃度、高頻率的使用這類殺菌劑，已經導致部分其它病原菌對包括嘧菌酯在內的多種此類殺菌劑產生了抗藥性；因此，嘧菌酯用于煙草赤星病的防治需要遵循國際殺菌劑抗性行動委員會（Fungicide Resistance Action Committee）的使用指南。

4 結論

研究結果證實嘧菌酯對赤星病菌孢子萌發的毒力（EC50值0.0540 mg/L）高于菌絲生長的毒力（EC50值25.8300 mg/L）。水楊肟酸能增強嘧菌酯對煙草赤星病菌的毒力，且孢子萌發階段更為明顯。真菌線粒體電子傳遞的旁路氧化途徑存在于煙草赤星病菌中，由于對菌絲生長和孢子萌發都具有較強的生物活性，嘧菌酯可進一步用于煙草赤星病的防治研究。

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Sensitivity of Alternaria alternata to azoxystrobin at the synergism of alternative oxidative inhibitor salicylhydroxamic acid

HUANG Yanfei1, CHEN Qingyuan2, WANG Jin3, XUE Juanjuan1, WANG Maosheng2, LU Hongxue1, SHANG Shenghua2,ZHANG Changqing1, WANG Hancheng2

1 College of Agriculture, Yangtze University, Jingzhou 434025, Hubei, China;
2 Key Laboratory of Molecular Genetics, Guizhou Academy of Tobacco Science, Guiyang 550081, China;
3 College of Life Science, Yangtze University, Jingzhou 434025, Hubei, China

This paper investigates the sensitivity of Alternaria alternata to Azoxystrobin in the synergistic effects of alternative oxidative inhibitor salicylhydroxamic acid (SHAM). Results showed that azoxystrobin inhibited both mycelial growth and conidial germination of A.alternata, with EC50 values of 25.8300 and 0.0500 mg L-1, respectively; while in the combination of 100 mg L-1 SHAM, it showed EC50 values of 15.5200 and 0.0038 mg L-1, respectively. SHAM presented no effects on mycelial growth or conidial germination of the pathogen.Studies showed that SHAM enhanced the sensitivity of A. alternata to azoxystrobin, and alternative oxidative pathway of electron transport chain existed in pathogen A. alternata., especially in the stage of conidial germination.

tobacco brown spot; azoxystrobin; salicylhydroxamic acid; sensitivity

黃艷飛，陳慶園，王進,等. 線粒體旁路氧化途徑抑制劑水楊肟酸(SHAM)協同下煙草赤星病菌對嘧菌酯的敏感性[J].中國煙草學報，2015,21（6）

國家自然科學基金（31360448、31501679）；中國煙草總公司貴州省公司科技項目（201305，201336，201436）；黔西南州煙草公司（2013-06）

黃艷飛(1989—)，在讀碩士研究生，主要從事煙草微生物研究，Email：974603170@qq.com

汪漢成(1982—)，博士，研究員，主要從事煙草植保及微生物方面的研究，Email：xiaobaiyang126@hotmail.com

張長青(1960—)，教授，植物病害，Email：qingchangzhang@tom.com

2015-03-13

:HUANG Yanfei, CHEN Qingyuan, WANG Jin, et al. Sensitivity of Alternaria alternata to azoxystrobin at the synergism of alternative oxidative inhibitor salicylhydroxamic acid [J]. Acta Tabacaria Sinica, 2015,21(6)