LC-MS/MS法測定水基膠中的3種異噻唑啉酮類防腐劑

盧昕博，肖衛強，許高燕，史春云，蔣健，周國俊

浙江中煙工業有限責任公司,杭州市西湖區科海路118號 310024

LC-MS/MS法測定水基膠中的3種異噻唑啉酮類防腐劑

盧昕博，肖衛強，許高燕，史春云，蔣健，周國俊

浙江中煙工業有限責任公司,杭州市西湖區科海路118號 310024

建立了測定水基膠中3種異噻唑啉酮的液相色譜-串聯質譜（LC-MS/MS）方法。水基膠樣品經水萃取、離心后進行LCMS/MS 分析，內標法定量。結果表明：MI、CMI在濃度范圍2.5～250 ng/mL、BIT在濃度范圍5～500 ng/mL內，線性關系良好（R2≥0.9996），3 個加標水平的加標回收率在96.3%～109.6%之間，平均相對標準偏差（RSD）在1.5%～6.7%之間，方法的檢出限（LOD）和定量限（LOQ）分別為0.011～0.015 mg/kg和0.035～0.051 mg/kg。該方法適用于水基膠中MI、CMI、BIT的快速測定。

異噻唑啉酮；LC-MS/MS；水基膠

異噻唑啉酮類化合物是一類高效、廣譜防腐劑，對細菌、真菌、藻類等具有良好的殺滅效果，被廣泛應用于工業循環冷卻水、膠黏劑、紡織、涂料、造紙等領域[1-4]。

水基膠是通過乳液聚合而成的含水膠乳，易受微生物侵襲，在水基膠中添加異噻唑啉酮可以起到殺菌防腐的作用。異噻唑啉酮類化合物，尤其是5-氯-2-甲基-異噻唑啉-3-酮（CMI）和2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮（MI）具有皮膚刺激性，并且是強過敏源，即使在規定濃度范圍仍有可能導致過敏[5-7]。歐盟指令規定化妝品中CMI/MI(3:1)混合物的添加上限為0.0015%，MI的添加上限為0.01%[8]。煙用水基膠由于可能會直接接觸消費者的口腔，其安全性非常重要，因此有必要建立水基膠中異噻唑啉酮含量的測定方法。

已報道的異噻唑啉酮類化合物分析方法的研究主要集中在家居產品、護膚品、環境水監測、紙制品等領域[9-12]。異噻唑啉酮的檢測方法主要有紫外分光光度法[13]、氣相色譜法(GC)[14]、氣相色譜-質譜聯用法 (GC-MS)[15]，液相色譜法 (HPLC)[16-17]和液相色譜-串聯質譜法（LC-MS/MS）[18]等。已有報道采用高效液相色譜法測定水基膠中異噻唑啉酮[19,20]，但高效液相色譜法分析時間長、靈敏度不高，相比之下LCMS/MS分析時間短、節省溶劑、靈敏度高，選擇性好，更加適合復雜體系中異噻唑啉酮類化合物的測定。本文建立了同時測定水基膠中3種異噻唑啉酮類防腐劑的LC-MS/MS方法，旨在快速準確測定水基膠中異噻唑啉酮的含量。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

市購水基膠樣品。

2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮（MI）、5-氯-2-甲基-異噻唑啉-3-酮（CMI）、1,2-苯并異噻唑基-3(2H)-酮（BIT）（純度≥98.0%，德國Dr.Ehrenstorfer 公司），內標1,2-苯并異噻唑基-3(2H)-酮-13C6（BIT-13C6）（純度≥98.0%，加拿大Tornoto Research Chemical公司）標樣，甲醇、甲酸（色譜純，美國Dikma 公司），水為自制超純水。

Thermo Scienti fi c TSQ Quantum Ultra三重四極桿質譜儀、Thermo Scienti fi c Surveyor Plus 高效液相色譜系統（美國Thermo Fisher公司）；CORTECS C18+ 色譜柱（2.1 mm ×100 mm，2.7 μm，90 ?，美國Waters 公司）；Sigma 4-16K高速離心機（德國Sigma公司）；KQ500-DB 超聲波發生器（江蘇昆山超聲儀器有限公司）；Milli-Q 超純水系統（美國Millipore 公司）；XP205 電子天平（感量：0.0001 g，瑞士Mettler-Toledo 公司）。

1.2 方法

1.2.1 標準溶液的配制

準確稱取50 mg MI、CMI、BIT于各自的50 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，得到濃度為1 mg/mL MI、CMI、BIT的標準儲備液；分別取1 mL BIT，0.5 mL的MI、CMI標準儲備液于100 mL 容量瓶中，以水定容，得到MI、CMI、BIT濃度分別為5 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL的混合標準溶液；準確稱取1 mg內標BIT-13C6于10 mL 容量瓶中，用水定容，得到濃度為100 μg/mL的內標溶液。

1.2.2 樣品處理與分析

準確稱取1 g樣品于100 mL錐形瓶中，加入20 mL水及20 μL內標溶液振蕩萃取10 min，以10000 rpm轉速離心15 min，取上層清液，經0.22 μm水相濾膜過濾后直接進樣分析。

LC-MS/MS條件為：色譜柱：CORTECS C18+色譜柱，配有預柱（2.1×5 mm，2.7 μm，90 ?）；流動相：A為甲醇，B為水；洗脫梯度：0～4 min，30%A → 60%A；4.1～6 min，100%A；6.1～ 8 min，30%A；流速：0.2 mL/min；柱溫：30℃ ；進樣體積：10 μL；離子源：電噴霧電離源（ESI）；掃描方式：正離子掃描；檢測方式：選擇反應監測（SRM）；電噴霧電壓：4000 V；離子源溫度：350℃ ；氣化溫度：350℃；碰撞氣為高純氬氣，壓力為0.20 Pa；鞘氣、輔助氣為氮氣，鞘氣流量：10 L/min，輔助氣流量：5 L/min；各防腐劑及內標的質譜采集參數如表1所示。

表1 MI、CMI、BIT、BIT-13C6的質譜采集參數Tab. 1 MS/MS acquisition parameters for MI, CMI, BIT and BIT-13C6

2 結果與討論

2.1 質譜條件的建立

MI、CMI、BIT均是含氮雜環化合物，易于結合氫離子形成正離子，因此選擇正離子模式進行檢測。將異噻唑啉酮標準儲備液及內標溶液稀釋一定倍數，得到濃度為1 μg/mL的標準樣品。通過注射泵將標準樣品以5 μL/min的流速導入質譜儀，同時以30%甲醇溶液做流動相并設置流速為0.2 mL/min，進行一級質譜分析，使待測化合物的準分子離子峰峰強度為106左右，優化透鏡補償電壓、噴霧電壓、鞘氣壓力、輔助氣壓力、離子源溫度、氣化溫度獲得待測化合物穩定的準分子離子峰。之后選擇碰撞氣壓力為0.2 Pa，分別對分子離子進行二級質譜碎片分析，優化碰撞能量，找到強度較大的3個子離子，其中豐度最高的特征子離子作為定量離子，其它兩個作為定性離子（表1）。定性條件為：樣品中待測物質的保留時間與標準品的保留時間偏差在6s之內；具有1個定量離子、2個定性離子；待測樣品定性離子的相對豐度與濃度臨近的標準工作溶液定性離子的相對豐度之間的偏差應在20%以內。

2.2 流動相的選擇

以甲醇-水作為流動相，考察了在0%～0.2%濃度范圍內甲酸對目標化合物質譜響應的影響。采用1.2.2的梯度洗脫程序，調節流動相中的甲酸濃度，待系統平衡后，進樣濃度為25 ng/mL的異噻唑啉酮混合標準樣品，平行進樣6次，取平均值，結果如圖1所示。隨著甲酸濃度的增加，目標化合物的質譜響應降低，因此，采用甲醇-水溶液作為流動相。

圖1 甲酸濃度對異噻唑啉酮質譜響應的影響Fig. 1 Effect of formic acid concentration on the MS response to isothiazolinones

2.3 前處理條件的確定

2.3.1 萃取溶劑的選擇

異噻唑啉酮在水及醇中溶解性都較好，但采用高濃度甲醇溶液萃取會產生以下兩個問題：水基膠中的異噻唑啉酮得到的萃取溶液與流動相不匹配，在流動相中會有不溶物析出；高濃度甲醇做萃取溶劑得到的樣品，由于溶劑效應會導致樣品峰變型、柱效降低。本文考察了水、30%甲醇、50%甲醇溶液對萃取效果的影響。選取市購含有3種異噻唑啉酮的水基膠樣品，分別稱取樣品1 g，加入20 mL溶劑萃取，在其他條件不變的情況下按1.2.2方法處理后進樣分析，結果如圖2所示：不同濃度的甲醇溶液對萃取效果影響不明顯。由于，水基膠在水溶液中的分散性更好，并且以水做溶劑萃取樣品經濟、環保，因此本文選擇水作為萃取溶劑。

圖2 不同濃度甲醇水溶液對異噻唑啉酮萃取效果的影響Fig. 2 Effect of methanol concentration on the extraction of isothiazolinones

2.3.2 萃取方式和時間的選擇

其他條件不變的情況下對樣品分別進行超聲萃取30 min和振蕩萃取30 min，結果如圖3所示。兩種萃取方式測得的異噻唑啉酮濃度接近，根據目測效果，振蕩萃取更有利于水基膠的分散，因此選擇振蕩萃取方式。

圖3 萃取方式對異噻唑啉酮萃取效果的影響Fig. 3 Effect of different extraction methods on the extraction of isothiazolinones

其他條件不變的情況下對樣品分別進行振蕩萃取10 min、20 min、30 min，結果如圖4所示。由于水基膠在水中分散性好，延長萃取時間對萃取效果沒有影響，因此，選擇萃取時間為10 min。

圖4 萃取時間對異噻唑啉酮萃取效果的影響Fig. 4 Effect of extraction time on the extraction of isothiazolinones

2.4 方法評價

2.4.1 標準工作曲線、檢出限與定量限

準確移取0.025 mL、0.05 mL、0.1 mL、0.25 mL、0.5 mL、1 mL、2.5 mL的混合標準溶液，置于50 mL容量瓶中，然后準確加入50 μL濃度為100 μg/mL的內標溶液，以水定容至刻度，即得MI、CMI濃度范圍為2.5～250 ng/mL BIT濃度范圍為5～500 ng/mL的系列標準工作溶液。按照1.2.2 節所述條件進行LCMS/MS 分析，標準溶液及樣品溶液選擇離子色譜圖如圖5、圖6所示。以異噻唑啉酮和內標物峰面積比對其相應濃度進行回歸，得到3種異噻唑啉酮的標準曲線，結果如表2所示。由表2可知，在所采用的色譜條件下，3種異噻唑啉酮均具有較好的相關性（R2≥0.9996），適合于定量分析。將最低濃度的標準工作溶液重復進樣10次，計算標準偏差，以3 倍標準偏差為方法的檢出限（LOD），10倍標準偏差為定量限（LOQ）。異噻唑啉酮的LOD范圍為 0.011～0.015 mg/kg，LOQ 范圍為 0.035～0.051 mg/kg。

圖5 異噻唑啉酮標準溶液SRM色譜圖Fig. 5 SRM chromatograms of isothiazolinones standards

圖6 樣品溶液SRM色譜圖Fig. 6 SRM chromatograms of isothiazolinones samples

表2 MI、CMI、BIT的回歸方程、檢出限及定量限Tab. 2 Regression equations, LOD and LOQ of MI, CMI and BIT

2.4.2 回收率與重復性

取水基膠樣品3份，分別按照低、中、高三個水平加入3種異噻唑啉酮標準溶液，每個添加水平重復測定5個樣品，并由加標量以及加標測定量計算回收率，結果見表3。從表3可知，3種異噻唑啉酮的平均加標回收率在96.3%～109.6%之間，平均相對標準偏差（RSD）在1.5%～6.7%之間，表明本方法回收率高，重復性好，適合定量。

表3 方法的的回收率與精密度Tab. 3 Recoveries and precisions of the method

2.5 實際樣品分析

采用本方法測定了10個市購樣品。10 個樣品中均檢出MI，含量范圍為0.13～2.47 mg/kg；有8個樣品檢出CMI，含量范圍為0.22～1.16 mg/kg；有1個樣品檢出有BIT，含量為0.37 mg/kg，其中，BIT不在歐盟指令化妝品防腐許可使用名單內。10個水基膠樣品中MI和CMI含量之和小于3.63 mg/kg，小于歐盟指令規定化妝品中CMI/MI混合物的添加上限。

3 結論

建立了水基膠中3種異噻唑啉酮類防腐劑的液相色譜-串聯質譜聯用（LC-MS/MS）分析方法。該方法線性良好（R2≥0.9996），加標回收率在96.3%～109.6%之間，平均相對標準偏差（RSD）在1.5%～6.7%之間，檢出限范圍為0.011～0.015 mg/kg，定量限范圍為0.035～0.051 mg/kg。相比液相色譜法[19,20]，該方法分析時間短、節省溶劑、靈敏度高、選擇性好，適合水基膠中MI、CMI、BIT的快速測定。

[1]付忠葉, 王慶, 賈蘭妮, 等. 異噻唑啉酮衍生物近10年的制備和應用研究進展[J]. 材料導報, 2012, 26(5) : 291-296.

[2]王向輝, 賀永寧, 盤茂東, 等. 異噻唑啉酮類衍生物的合成及應用研究進展[J]. 海南大學學報:自然科學版,2008, 26(4): 372-377.

[3]Reinhard E, Waeber R, Niederer M,et al.Preservation of products with MCI/MI in Switzerland [J]. Contact Dermatit.2001, 45(5): 257-264.

[4]Critchley M, Bentham R. The ef fi cacy of biocides and other chemical additives in cooling water systems in the control of amoebae [J]. J Appl Microbiol. 2009, 106(3): 784-789.

[5]Fewings J, Menné T. An update of the risk assessment for methylchloroisothiazolinone/methylisothiazolinone (MCI/MI) with focus on rinse-off products [J]. Contact Dermatit.1999, 41(1): 1-13.

[6]García-Gavín J, Vansina S, Kerre S,et al.Methylisothiazolinone, an emerging allergen in cosmetics[J]. Contact Dermatit. 2010, 63(2): 96-101.

[7]Isaksson M, Gruvberger B, Bruze M. Occupational contact allergy and dermatitis from methylisothiazolinone after contact with wallcovering glue and after a chemical burn from a biocide [J]. Dermatitis. 2004, 15(4): 201-205.

[8]European Parliament, Council, Regulation, EC: 1223/2009[EB/OL]. http://eur-lex.europa.eu/legal-content/EN/ALL/;ELX_SESSIONID=L4b4JsBf5LGxThh MhjGhr91pGJslPRzYkDbjt7RpD73hPGG6xwrT!-717403053?uri=CELEX:32009R1223

[9]Alvarez-Rivera G, Dagnac T, Lores M,et al. Determination of isothiazolinone preservatives in cosmetics and household products by matrix solid-phase dispersion followed by high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry [J]. J Chromatogr A. 2012, 1270: 41-50.

[10]簡龍海, 聞宏亮, 孫健, 等. 液相色譜-串聯質譜法同時測定化妝品中的甲基異噻唑啉酮和甲基氯異噻唑啉酮[J]. 中國衛生檢驗雜志, 2011, 21(11): 2652-2653.

[11]Bester K, Lamani X. Determination of biocides as well as some biocide metabolites from facade run-off waters by solid phase extraction and high performance liquid chromatographic separation and tandem mass spectrometry detection [J]. J Chromatogr A. 2010, 1217(32): 5204-5014

[12]Lin QB, Wang TJ, Song H,et al. Analysis of isothiazolinone biocides in paper for food packaging by ultra-highperformance liquid chromatography-tandem mass spectrometry [J]. Food Addit Contam Part A Chem Anal Control Expo Risk Assess. 2010, 27(12): 1775-1781.

[13]鄭靜, 陳燕青, 龔晨, 等. 紫外分光光度法用于殺菌劑1,2-苯并異噻唑啉-3-酮的分析[J]. 鄭州大學學報:理學版, 2011, 43(1): 122-124.

[14]Nakashima H, Matsunaga I, Miyano N,et al. Determination of Antimicrobial Agents in Non-Formalin Adhesives for Wallpaper [J]. Journal of Health Science, 2000, 46(6) : 447-454.

[15]Rafoth A, Gabriel S, Sacher F,et al. Analysis of isothiazolinones in environmental waters by gas chromatography-mass spectrometry [J]. J Chromatogr A.2007, 1164(1-2): 74-81.

[16]林芳, 毛樹祿, 陳斌, 等. 皮革中異噻唑啉酮防霉劑的檢測方法[J]. 中國皮革, 2011, 40(7): 5-10.

[17]王超, 張青, 王星. 化妝品中甲基異噻唑啉酮及其氯代物的高效液相色譜測定法[J]. 環境與健康雜志, 2007,24(6): 449-450.

[18]楊榮靜, 衛碧文, 于文佳, 等. 液相色譜-串聯質譜法檢測玩具中的3種異噻唑啉酮類防腐劑[J]. 色譜, 2011,29(6): 513-516.

[19]周曉,李小蘭, 陳志燕,等. 高效液相色譜法測定水基膠黏劑中3種異噻唑啉酮類殺菌劑[J]. 色譜, 2015, 33(1):75-79.

[20]Rosero-Moreano M, Canellas E, Nerín C. Three-phase hollow-fiber liquid-phase microextraction combined with HPLC-UV for the determination of isothiazolinone biocides in adhesives used for food packaging materials[J]. J Sep Sci, 2014, 37(3): 272-280.

Determination of 3 isothiazolinone preservatives in water-based adhesive by LC-MS/MS method

LU Xinbo, XIAO Weiqiang, XU Gaoyan, SHI Chunyun, JIANG Jian, ZHOU Guojun
China Tobacco Zhejiang Industrial Co., LTD., Hangzhou 310024, China

A method for determining 3 isothiazolinone preservatives in water-based adhesive by high performance liquid chromatographytandem mass spectrometry (LC-MS/MS) was developed. The sample was extracted with water, centrifugated, and then analyzed by LCMS/MS and quanti fi ed by internal standard method. Results showed that: the linear relationship was good with determination coef fi cients R2≥ 0.9996 in the MI and CMI concentration range of 2.5～250 ng/mL and in the BIT concentration range of 5～500 ng/mL. The recoveries of standard addition ranged from 96.3% to 109.6% with relative standard deviation (RSD) of 1.5%～6.7%. The limit of detection was between 0.011 and 0.015 mg/kg, and that of quanti fi cation was between 0.035 and 0.051 mg/kg. It was concluded that this method was suitable for the determination of 3 isothiazolinone preservatives in water-based adhesive.

isothiazolinone; LC-MS/MS; water-based adhesive

盧昕博,肖衛強,許高燕,等. LC-MS/MS法測定水基膠中的3種異噻唑啉酮類防腐劑[J]. 中國煙草學報，2015,21（4）

盧昕博（1981—），博士，工程師，主要從事煙草化學研究工作，Email：luxb@zjtobacco.com

周國俊（1973—），博士，研究員，主要從事煙草化學研究工作，Email：zhougj@zjtobacco.com

2015-02-14

:LU Xinbo, XIAO Weiqiang, XU Gaoyan, et al. Determination of 3 isothiazolinone preservatives in water-based adhesive by LCMS/MS method [J]. Acta Tabacaria Sinica, 2015, 21(4)