煙草成熟期土壤細菌群落結構及多樣性

李小林，李強，彭衛紅，甘炳成，鄭林用，張小平

1 四川省農業科學院/土壤肥料研究所，成都 610066；2 四川大學/生命科學學院，成都 610065；3 四川農業大學，資源環境學院微生物系，四川成都 611130

煙草成熟期土壤細菌群落結構及多樣性

李小林1，李強2，彭衛紅1，甘炳成1，鄭林用1，張小平3

1 四川省農業科學院/土壤肥料研究所，成都 610066；2 四川大學/生命科學學院，成都 610065；3 四川農業大學，資源環境學院微生物系，四川成都 611130

為研究煙草成熟期(下部葉采收期)根際及非根際土壤細菌群落結構和多樣性，利用PCR-DGGE技術對攀枝花市鹽邊縣主要煙區采集的5個煙草根際土樣和5個非根際土樣進行分析。結果表明，非根際與根際土壤細菌群落結構差異顯著，非根際土壤的細菌多樣性甚至超越根際, 表明煙草成熟期根際效應沒有顯現，并且有減弱甚至負向效應出現，這可能與煙草成熟期根系分泌物的影響有關。條帶克隆測序表明，根際土壤中優勢細菌的群落結構更為豐富，而非根際土壤中則相對較弱。Steroidobacter菌是煙田土壤中的優勢細菌；硝化螺菌屬(Nitrospira)細菌、Rhizobiales目下未定類細菌等為煙草根際土壤中優勢細菌；放線菌目(Actinomycetales)未定類放線菌和Chitinophagaceae科未定類細菌為非根際土壤中優勢細菌。研究證明成熟期的煙草根際效應出現一定程度減弱。

煙草；成熟期；細菌；群落結構；根際效應；DGGE

煙草成熟期土壤微生物尤其是土壤細菌群落結構變化對煙草的品質有著重要的影響[1]。研究了解煙草土壤的細菌群落結構變化可以為指導煙草生產提供基礎理論支持。并為改良土壤生態，提高煙草產量及品質提供研究思路。目前對煙草周圍環境微生物的研究主要集中在研究其內生菌[2-5]，探索其內生菌的抗菌及促生作用，對其土壤微生物尤其是細菌群落結構的研究還有待加強。林鳳敏等[6]運用純培養法和基于16S rRNA 基因序列的系統發育分析對煙草根際與非根際土壤中可培養細菌多樣性進行了研究，發現煙草根際與非根際土壤中含有較為豐富的微生物資源。但是這種可培養技術僅能分離出1%～10%的土壤微生物。PCR-DGGE 技術為不可培養微生物的分析提供了有利的手段，具有檢測極限低、靈敏度高等優勢，已經廣泛應用于環境微生物研究中[7-11]。吳鳳芝等[12]將 DGGE 方法應用于研究黃瓜輪作及套作對土壤細菌種群的影響，發現輪套作對黃瓜根際土壤細菌種群的種類、數量和黃瓜產量具有一定的影響，提高了土壤細菌種群多樣性指數、均勻度指數和黃瓜產量。李坤等[13]利用該技術研究葡萄連作對土壤細菌和真菌種群結構及多樣性的影響，發現葡萄連作后土壤細菌和真菌的多樣性增加，且根圍土壤的微生物多樣性高于非根圍土壤。

本研究擬通過 PCR-DGGE技術對煙草成熟期(下部葉采收期)的根際及非根際土壤細菌群落結構和多樣性進行研究，以期對科學評價煙田生態系統的健康程度及作物生長的潛力進行預測，為煙草的科學種植提供依據和指導。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

樣品采自四川省攀枝花鹽邊縣鳡魚鄉、永興鎮、格薩拉鄉及魚門鎮等主要煙草產區長勢均勻的煙田。采集時間為煙草成熟期(下部葉采收期)，煙草品種為云煙87，按五點法取樣，每個采集點選取10～15株健康煙草植株，連根帶土將其拔出，抖掉表面大塊的土作為非根際土壤，用標號“B”代表，取緊貼根表附著的土樣為根際土壤，用“R”代表。土壤均勻混合后，四分法去掉多余土壤，裝入無菌袋中，貼上標簽，并用冰袋保存，立即帶回實驗室。

帶回實驗室的土壤樣品經研磨過2 mm尼龍網篩后，裝入無菌塑料袋，置于4 ℃冰箱保存，以供可培養微生物分離與計數等分析；剩下的土樣保存于-20℃，供土壤總DNA提取分析。

1.2 土壤總DNA的提取與純化

樣品總DNA的提取采用Fast DNA SPN Kit for Soil (Bio-Rad Co., 美國)試劑盒方法，稱取0.5 g土樣，按試劑盒說明書進行土壤總DNA提取。用UNIQ-10 DNA純化試劑盒（上海生工）對土壤總DNA進行純化，于-20℃保存備用。

1.3 細菌16S rDNA的擴增

細菌16S rDNA的擴增采用引物F338GC(5′-C G C C C G C C G C G C G C G G C G G G C G GGGCGGGGGCACGGGGGG-3′)和 R518(5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′)。 反 應 體 系 (50 μL)：2×PCR Mix (0.1 U Taq 酶 /μL, 500 μM dNTP each, 20 mM Tris-HCl pH 8.3, 100 mM KCl和3 mM MgCl2) 25 μL；正向引物(25 pmol L-1) 0.5 μL；反向引物(25 pmol L-1) 0.5 μL；模板DNA(30-50 ng mL-1)2.0 μL；無菌雙蒸水補足至50 μL。擴增程序采用Touch-down PCR程序：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性1 min，65-55℃退火50 （s每個循環溫度降低0.5 ℃），72 ℃延伸1.5 min，共20個循環，然后在其它條件不變的情況下，在55℃的退火溫度下擴增15個循環結束后，72 ℃延伸7 min，產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，100V電壓下電泳，EB染色，用自動凝膠成像系統拍照，然后4 ℃恒溫保存。

1.4 PCR產物的變性梯度凝膠電泳(DGGE)分析

取PCR擴增產物15-20 μL，加2-5 μL溴酚藍進行DGGE分析。10%聚丙烯酰胺凝膠(100%的變性劑為尿素7 mol L-1和40%的去離子甲酰胺)，變性梯度為25%～55%。使用1×TAE緩沖液，50 V 50 min進膠，再在160 V 60 ℃下電泳5 h。電泳后采用改進的硝酸銀染色法對凝膠進行染色。用數碼相機拍照保存。

1.5 DGGE優勢及特異條帶的回收分析

將優勢和特異性的條帶割下，用無菌去離子水清洗2次，并用15 μL去離子水浸泡過夜，用浸泡夜或者直接挑取一小塊膠(＜1 mm3)作DNA模板，然后用F338(去GC發夾)及R518進行PCR擴增，體系和程序同上。將擴增后的PCR產物通過凝膠回收試劑盒回收目的條帶，進行克隆并挑克隆子送上海英駿生物技術公司測序。

1.6 DGGE數據分析

所有用于DGGE技術分析的樣品均設置兩次技術重復。DGGE指紋圖譜用Bio-Rad公司的Quantity One 4.1.1分析軟件進行分析，通過檢測條帶，匹配條帶，扣除背景強度，對目的條帶進行標記，根據各樣品電泳條帶的多少及密度對煙草土壤樣品的微生物多樣性進行分析。其中香農指數(Shannon-Wiener index, H)和均勻度(Evenness index, EH)根據如下公式計算：

克隆所測的序列，在BLAST上去除載體序列，然后通過Blast中GenBank中核酸數據進行比對分析，選取標準菌株，采用軟件MEGA 5.0中Clustal X 程序進行多序列比對，然后用Neighbor-Joining 方法選擇Bootstrap 為1000 個重復構建系統發育進化樹。由于所得序列低于500 bp，所以細菌選取GenBank和RDP(Ribosomal Database Project)兩個數據庫進行比對和分析。

2 結果與分析

2.1 細菌DGGE圖譜群落結構

DGGE圖譜直觀地展現了根際與非根際土壤樣品細菌群落結構之間的差異 (圖1)。無論是根際與根際之間、非根際與非根際之間、同一樣點之間的樣品條帶數目之間的差異都較為明顯，顯現出一定的細菌多樣性。所有樣品中條帶數目最多的為非根際土壤B3，而條帶最少的為B5。而在根際樣品中，條帶數目最高的為R4，最少的則為R1。根際較之非根際，其根際效應沒有系統出現，并且有減弱甚至負向效應出現，如1號和3號樣點非根際樣品條帶數目大于根際樣品。可見非根際土壤的細菌多樣性在所有樣品中的影響力甚至超越根際。

根據泳道對比，可計算出樣品間的戴斯相似性指數(表1)。所有樣品間相似性均低于50%，超過40%的有5組，低于20%的有4組。其中相似性最高的為47.2%(R5與B5)，相似性最低的為13.9%(B3與B5)。同時共有兩個樣點的根際與非根際間的相似水平超過40%(R2與B2，R5與B5)，顯示相對較高同源性。

表1 細菌DGGE泳道相似矩陣Tab.1 Similarity matrix of DGGE patterns of bacteria

根據DGGE圖譜數字化結果進行了其細菌群落結構組成的主成分分析，其中第一個主成分能解釋總變量的18.84%，第二個主成分能解釋總變量的15.93%，前兩個共能解釋總變量的34.76%(圖2)。結果顯示，B3與其它樣品的細菌群落結構差異較大，其次為B5。來源于根際或是非根際的樣品并沒有系統聚集一起，而是相互散落其間。同一樣點中，根際與非根際之間細菌群落結構有一定差異的同時又具有一定同源性，如2、4和5號樣點的根際土與非根際土距離并不是很遠，尤其是2號樣點。

2.2 細菌DGGE圖譜多樣性

細菌DGGE圖譜多樣性指數能比較真實客觀地反映煙草土壤樣品中細菌多樣性的信息(表2)。結果顯示，煙草根際與非根際樣品的細菌多樣性指數之間有很大的差異，三個多樣性指數均表明系統的細菌根際效應在煙草成熟期開始消失。樣點1和3號中，根際香農指數(H)和豐富度(S)均明顯小于非根際。同時，細菌根際效應減弱的證據也體現在均勻度(EH)中。

2.3 細菌DGGE代表條帶序列分析

根據細菌DGGE圖譜，選取了部分優勢和特異條帶進行測序分析，最后成功克隆10個條帶的基因。所以選取GenBank和RDP兩個數據庫進行比對和分析。根據代表條帶在GenBank中比對結果，選取20個可培養或免培養序列作為參比序列共同構建系統發育樹(圖3)。

在系統發育樹中，所有序列隸屬于變形菌門(Protebacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、放線菌門(Actinobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)及硝化螺旋菌門(Nitrospira)。整個發育樹可分為兩個大簇，其中簇I包含6個克隆條帶，簇II包含4個克隆條帶。

簇I可分為三個亞簇，B2C-2、B1C-4及B4C-3和4個隸屬于α-變形菌(α-Proteobacteria)的可培養細菌及兩個免培養細菌聚為第一個亞簇。在第二個亞簇中，B1C-1和隸屬于β-變形菌(β-Proteobacteria)的Pandoraea sp. R1717 (EU090895)聚為一個小類，而B5R-4則與一株隸屬擬桿菌門(Bacteroidetes)及一個免培養克隆序列聚為一個小類。B2C-4所在的第三亞簇與其它兩個亞簇遺傳距離較遠，屬于放線菌門(Actinobacteria)。

表2 煙草土壤樣品DGGE圖譜多樣性Tab.2 Diversity of DGGE pro fi les in tobacco soil samples

簇II共兩個亞簇，第一個亞簇由一株隸屬于γ-變形菌(γ-Proteobacteria)及一株免培養細菌構成。第二個亞簇中，B4R-2與另兩個代表條帶相距較遠，與隸屬于酸桿菌門(Acidobacteria)的兩個序列聚在一起。同時B4R-3、B4R-5和兩株硝化螺旋細菌及兩個免培養細菌序列為第三個亞簇。

所有細菌DGGE圖譜條帶的克隆序列基于RDP數據庫分類定位及其在煙草土壤樣品中的分布見表3。所有克隆中，只有4個克隆能分類到屬，分別為 B1C-1 (Pandoraea)、B4R-3 (Nitrospira)、B4R-4(Steroidobacter)及B4R-5 (Nitrospira)；有3個能分類到目，分別是B1C-4 (Rhizobiales)、B2C-2 (Rhizobiales)和B2C-4 (Actinomycetales)；另外B4R-2只能分類到酸桿菌門(Acidobacteria)，B4C-3只能分類到α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)，B5R-4只能分類到Chitinophagaceae科。

表3 條帶克隆在RDP數據庫中的分類及在樣品中的分布Tab.3 Taxonomy of clone in RDP of clones and its distribution in samples

除克隆B4R-3只在根際土壤中存在之外，大部分條帶在根際和非根際中均有分布，而同為硝化螺菌(Nitrospira)的代表條帶B4R-5也主要在根際樣品中出現，表明硝化螺菌屬(Nitrospira)細菌是根際土壤中的優勢細菌之一。同時余下的代表克隆序列B2C-2、B4R-4及B4C-3在根際樣品中出現的概率超過60%，為煙草根際土壤中優勢細菌。而在非根際樣品中，代表克隆B2C-4、B4R-4及B5R-4出現的概率高于60%。

根際土壤中優勢細菌的群落結構更為豐富，而非根際土壤中則相對較弱。無論在根際還是非根際中，Steroidobacter屬細菌出現概率均較高，表明Steroidobacter菌是煙田土壤中的優勢細菌。同時，硝化螺菌屬細菌、Rhizobiales目下未定類細菌和α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)下未定類細菌為煙草根際土壤中優勢細菌。而放線菌目(Actinomycetales)未定類放線菌和Chitinophagaceae科未定類細菌為非根際土壤中優勢細菌。

圖3 DGGE條帶細菌16S rRNA基因系統發育樹Fig. 3 Phylogenetic analysis of 16S rRNA gene sequences of bacteria from DGGE bands

3 討論與結論

植物根際細菌作為一類重要的微生物，植物的生長發育有著密切的關系[14-15]，植物與其能夠相互影響和作用，有時這種作用是互利的，有時卻是偏利的，甚至有時對某一方有害。不同種類的植物根際細菌數量、種群及優勢細菌等都有較大的差異[16-17]。劉洪華[18]運用PCR-DGGE分析煙草根際土壤細菌群落結構及多樣性時發現，細菌的種類變化隨著土壤類型及植物生長發育時期而變化，在大部分土壤中煙葉采收期細菌多樣性指數要小于旺長期。煙草生長后期根際細菌多樣性小于生長旺期是否與根分泌物的多少及種類有關？答案是肯定的，植物通過其根分泌物影響土壤而影響土壤微生物群落結構及其多樣性[19]。陳冬梅等[20-21]在對盆栽煙草外源添加不同濃度植煙土壤提取物質時發現，外源添加物質處理后，煙草根際土壤細菌群落減少，多樣性水平下降。在本研究中，通過DGGE分析結果也表明煙草的種植對免培養細菌群落結構及多樣性有比較明顯的影響。結果顯示，系統的根際效應在煙草土壤細菌多樣性中均無法體現，甚至有的樣點出現了負根際效應現象。這與我們前期對硝化細菌和nifH基因的研究較為類似，雖然煙草成熟期(下部葉采收期)的根際硝化細菌和nifH基因多樣性程度總體優于非根際土壤，但系統的根際效應已無法體現[22-23]。

結果表明，相對于非根際土壤樣品，根際土壤中優勢細菌的菌群種類更為豐富。由于DGGE成功克隆的條帶數量有限，所獲得的免培養細菌種群信息也較為有限，但通過分析仍可以清晰的發現，煙草根際土壤中優勢免培養細菌為Steroidobacter屬、硝化螺旋菌屬、根瘤菌目(Rhizobiales)和α-變形菌；煙草非根際土壤中優勢免培養細菌為Steroidobacter屬、放線菌目(Actinomycetales)和Chitinophagaceae科。

總體上看，煙草根際土壤和非根際土壤中優勢免培養微生物的物種豐富度比較接近，但是非根際土壤中微生物表現出更強的特異性。相對于非根際樣品，免培養微生物群落結構在根際樣品中的同源性表現出更強的趨勢，印證了煙草生長后期根際環境的惡化。只出現在根際土壤樣品中的微生物只有栓菌屬(Trametes)；非根際特有微生物包括假諾卡氏菌(Pseudonocardia)、厄氏菌(Oerskovia)、小單孢菌(Promicromonospora)、蠟蚧菌屬(Lecanicillium)、假單孢菌屬(Pseudomonas)。

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Study on diversity and community structure of bacteria in soils at tobacco maturing stage

LI Xiaolin1，LI Qiang2，PENG Weihong1，GAN Bingcheng1，ZHENG Linyong1，ZHANG Xiaoping3
1 Soil and Fertilizer Institute, Sichuan Academy of Agricultural Sciences, Chengdu 610066, China;2 College of Life Science, Sichuan University, Chengdu 610065, China;3 Department of Microbiology, College of Resource and Environment, Sichuan Agricultural University, Chengdu 610031, China

Five tobacco rhizosphere soil samples and fi ve non-rhizosphere soil samples were collected from main tobacco-growing areas of Yanbian County and analyzed by PCR-DGGE technology. Results showed that the bacteria community structure and diversity showed signi fi cant difference among different soils, and the bacteria diversity of non-rhizosphere soil was even higher than that of rhizosphere soil, which indicated that rhizosphere effect weakened at tobacco maturing stage due to rhizosphere secretion. Moreover, the dominant bacteria community structures of rhizosphere soil were more abundant than those in non-rhizosphere soils. Steroidobacter was a dominant bacteria group in tobacco soil.Nitrospira and Rhizobialeswere the dominant bacteria in tobacco rhizosphere soil andActinomycetales and Chitinophagaceaewere dominant in non-rhizosphere soil. This study showed that tobacco rhizosphere effect weakened at maturing stage.

tobacco; mature stage; bacteria; community structure; rhizosphere effect; DGGE

李小林，李強，彭衛紅,等. 煙草成熟期土壤細菌群落結構及多樣性[J]. 中國煙草學報，2015,21（4）

國家863計劃項目(2013AA102802)

李小林（1985—），博士，助理研究員，主要研究方向為微生物多樣性，Email：kerrylee_tw@sina.com

張小平（1962—），博士，教授，主要研究方向為土壤微生物多樣性及固氮生物，Email：zhangxiaopingphd@126.com

2014-06-22

:LI Xiaolin，LI Qiang，PENG Weihong, et al. Study on diversity and community structure of bacteria in soils at tobacco maturing stage [J]. Acta Tabacaria Sinica, 2015, 21(4)