基于脯氨酸仿生合成的納米TiO2吸附牛血清白蛋白行為的研究

宮建龍,楊良軍,朱龍寶,劉任龍,陶玉貴,梁敏東

(安徽工程大學生物與化學工程學院,安徽蕪湖 241000)

基于脯氨酸仿生合成的納米TiO2吸附牛血清白蛋白行為的研究

宮建龍,楊良軍,朱龍寶,劉任龍,陶玉貴,梁敏東

(安徽工程大學生物與化學工程學院,安徽蕪湖 241000)

以基于脯氨酸仿生合成的納米TiO2為吸附劑,研究其對牛血清白蛋白(BSA)的吸附行為,并采用傅立葉變換紅外光譜(FT-IR)以及差熱-熱重分析(DTA-TG)對其界面進行表征．研究結果表明:吸附等溫線符合Langmuir吸附模型,為單分子層吸附,最大吸附量為40．1 mg/g,吸附常數為5．71 m L/mg;吸附過程可用Lagergren擬一級動力學方程描述;吸附過程為放熱物理吸附．界面表征納米TiO2與BSA間吸附作用力為氫鍵和范德華力,與擬合曲線的分析結果相吻合．

納米二氧化鈦;牛血清白蛋白;吸附行為;吸附動力學

仿生合成的納米TiO2作為一種高新材料[1],除了具有更大的比表面積、尺寸可控特性以及優異的表面效應外,還具有良好的生物相容性和化學穩定性等特點[2-3],在生物醫用材料領域研究廣泛[4-5]．

目前,納米TiO2用作生物醫用材料,主要集中在材料與蛋白質之間發生吸附的條件研究[6-7],對于材料與蛋白質之間吸附過程中物質與熱量的交換研究還有待深入．然而,材料與蛋白質分子之間物質與熱量的交換直接影響材料對蛋白質分子的吸附量、吸附速率,熱量之間的相互轉化將會對吸附類型產生影響,從而進一步影響吸附的自發性[8]．血清白蛋白(BSA)在生物體中起著血液緩沖劑、維持血液滲透壓、載運等作用,是人體及動物體內最重要的蛋白之一,常作為研究蛋白質復合材料的模式蛋白．因此,研究BSA與仿生合成納米TiO2間的吸附行為,對揭示納米材料與蛋白質之間的相互作用有著一定的意義[9]．

以基于脯氨酸仿生合成的納米TiO2為吸附劑,通過吸附模型、動力學以及熱力學參數等研究仿生納米TiO2與BSA之間的吸附行為,并輔以FT-IR以及DTA-TG對擬合結果進行驗證．

1 材料與方法

1．1 納米TiO2的仿生合成

依據文獻方法[10]將4 mmol脯氨酸溶于蒸餾水中制成溶液,并將無水乙醇緩慢加入溶液中,在強攪拌情況下加入4 m L鈦酸正四丁酯,室溫攪拌1 h．再將乳白色混合物轉入反應釜中,水熱反應24 h,抽濾,用無水乙醇、蒸餾水清洗,將得到的沉淀物進行干燥,干燥后放在空氣中煅燒3．5 h,得到樣品．通過XRD (采用Bruker D8 Advance型X射線衍射儀)、SEM(采用日立S-4800掃描電鏡)以及比表面積及孔徑(采用美國康塔NOVA 2000e比表面積及孔徑分析儀)表征,制備的納米TiO2為銳鈦礦晶型,尺寸為80～150 nm,比表面積為61．42 m2/g,平均孔徑為56．36 nm,平均孔體積為0．218 cm3/g．

1．2 載體TiO2吸附BSA

將50 mg的載體TiO2吸附劑放入40 m L的樣品瓶中,然后加入25 m L 0．1～1．0 mg/m L BSA(上海金穗生物科技有限公司)溶液,旋緊瓶蓋,將樣品瓶置于25℃的恒溫振蕩箱中,振蕩攪拌300 min,達到吸附平衡后,離心分離,利用改進型Lowery法蛋白質定量試劑盒(上海近岸科技有限公司,線性范圍1．0～1500μg/m L)測定溶液的BSA濃度．

1．3 載體TiO2對BSA的吸附行為

(1)平衡吸附量．平衡吸附量qe(mg/g)由式(1)計算:

式中,c0,ce分別為基質的起始和平衡質量濃度(mg/m L);V為溶液體積(m L);W為吸附劑的質量(g)．

(2)等溫吸附線．采用Langmuir吸附模型對實驗數據進行擬合,以分析吸附劑的吸附特性,吸附劑的吸附量可由式(2)計算:

式中,qmax最大吸附量(mg/g);Ka為吸附劑的吸附常數(m L/mg)．

(3)吸附動力學．吸附動力學用Lagergren擬一級動力學方程來描述:

式中,qe,q為BSA的平衡時和時間t時的吸附量(mg/g);k為吸附劑的結合速度常數(min－1)．

(4)吸附熱力學．采用分批結合實驗,由等溫吸附線求得結合常數,以ln Ka對1/T作圖,采用如式(3)所示Vant＇Hoff方程對數據點擬合,由直線的斜率和截距可求得ΔrHm和ΔrSm．ΔrHm絕對值越大,說明基質與吸附劑的親和力越強,形成的復合物越穩定;ΔrSm絕對值越大,說明基質與吸附劑形成復合物時構象變化越大．

式中,Ka為BSA在吸附劑的吸附平衡離解常數;ΔrGm、ΔrHm和ΔrSm分別為BSA與吸附劑相互作用的自由能變、焓變和熵變．

1．4 界面表征

吸附了BSA的吸附劑經離心分離,用超純水和磷酸鹽緩沖液進行洗滌,冷凍干燥,利用Prestige-21傅立葉變換紅外光譜儀(日本島津公司)及TGA-2050熱分析儀(美國TA-Instruments公司)對界面表征．

2 結果與討論

2．1 吸附等溫線

溶液p H對吸附影響如圖1所示．由圖1可知,在接近BSA等電點(4．8)時,吸附效果最好,因此吸附實驗的BSA溶液都用磷酸鹽緩沖液調節為p H值＝5．0．分別以25 mg載體TiO2吸附25 m L初始質量濃度為0．1 mg/m L、0．2 mg/m L、0．3 mg/m L、0．4 mg/m L、0．6 mg/m L、0．8 mg/m L、1．0 mg/m L的BSA溶液．采用式(2)對實驗數據進行擬合得圖1的吸附等溫線,圖1中橫坐標為不同質量濃度下吸附平衡時的BSA質量濃度,縱坐標為載體TiO2對BSA的結合量．作為對比,采用Freundlich模型對數據進行擬合得圖1中的虛線．擬合所得的參數如表1所示．

表1 Langmuir和Freundlich方程參數

采用Langmuir模型所得擬合曲線的相關性R2＞0．999,實驗數據與式(2)非常吻合,說明吸附過程為單分子層吸附,BSA飽和吸附量為40．1 mg/g,吸附常數為5．71 m L/mg．飽和吸附量取決于吸附劑的比表面積,吸附常數與吸附劑和BSA分子間的作用力有關．

2．2 吸附動力學

分別以25 mg載體TiO2吸附25 m L初始質量濃度為0．6 mg/m L和1．0 mg/m L的BSA溶液,測吸附時間分別為5 min、10 min、15 min、20 min、40 min、80 min、120 min、160 min、200 min、240 min、300 min的吸附量,按照式(3)對實驗數據進行擬合,得到的吸附動力學曲線如圖2所示．作為對比,采用擬二級動力學模型對數據進行擬合得圖2中虛線．擬合所得的參數如表2所示．

表2 吸附動力學模型參數

采用擬一級動力學模型所得擬合曲線的相關性R2＞0．998,說明納米TiO2對BSA的吸附行為可用一級動力學模型來描述．由擬二級動力學模型擬合所得的平衡吸附量大于吸附實驗的平衡吸附量,這與事實不符,說明吸附過程不能用擬二級動力學模型來描述．納米TiO2對BSA的吸附過程可分為三步:液膜擴散、孔道擴散和吸附．對于物理吸附,吸附質分子與孔表面的碰撞和定向作用而被吸附幾乎是瞬間完成的,因此,吸附速率受前兩步擴散控制,通常在吸附初期過程速度受外擴散控制,吸附后期過程速度受內擴散控制．從圖2中可以看出,納米TiO2對BSA的吸附量隨著時間的增加而增大．0～120 min內吸附量迅速增加,此為快速吸附過程,由濃度推動力控制顆粒擴散;120～240 min內吸附量增加緩慢,在240 min后吸附量基本不變,達到吸附平衡．納米TiO2對低質量濃度(0．6 mg/m L)BSA溶液吸附,在160 min時接近吸附平衡,對高質量濃度(1．0 mg/m L)BSA溶液吸附,在200 min時接近吸附平衡,說明在低質量濃度中達到吸附平衡所需時間較短．

2．3 吸附熱力學

在298 K、308 K、318 K和328 K溫度下,以0．050 g載體TiO2吸附25 m L不同質量濃度的BSA溶液,采用Langmuir吸附模型對所測數據進行擬合,得到不同溫度下的吸附等溫線如圖3所示．求得不同溫度下的吸附常數與最大吸附量如表3所示．以1/T為橫坐標,ln Ka(m L/mg)為縱坐標作圖,擬合所得直線如圖4所示．由直線的斜率和截距計算出吸附過程的ΔrHm為－18．7 kJ/mol和ΔrSm為－48．1 J/(mol·K)．

表3 不同溫度下納米TiO2吸附BSA的吸附常數和最大吸附量

從圖3和表3可以看出,隨著溫度的升高,納米TiO2對BSA的最大吸附量減小,吸附常數(Ka)降低,說明是物理吸附．ΔrHm為負值,吸附過程為放熱反應,升高溫度,不利于吸附,這與實驗結果相一致．|ΔrHm|＜40 kJ/mol表明納米TiO2與BSA以非共價鍵相互作用,升高溫度,非共價鍵相互作用減弱,吸附量減小．ΔrSm為負值表明吸附過程中體系的有序性增加．

2．4 吸附界面表征

(1)FT-IR表征．納米TiO2、BSA以及納米TiO2-BSA結合物的FT-IR光譜如圖5所示．圖5a中400～950cm－1有一平而寬的紅外吸收帶,此吸收峰為Ti-O-Ti吸收峰．3 451．85cm－1的吸收峰是納米TiO2表面配位的少量水中O－H的伸縮振動峰,而1 632．55cm－1的吸收峰是彎曲振動的結果．圖5b中1 653．65cm－1和1 536．82cm－1的特征峰分別處于酰胺Ⅰ帶的α-螺旋區域和酰胺Ⅱ帶區域．吸收主要是與BSA分子中氨基酸殘基的羰基伸縮振動吸收以及與羰基和酰胺的氫形成的氫鍵有關．圖5c中不僅具有Ti-O-Ti吸收峰,也存在BSA特征峰,并且1 653．65cm－1的伸縮振動吸收峰轉移到了1 662．72cm－1, 1 536．82cm－1處的N－H彎曲振動吸收峰轉移到了1 569．39cm－1,說明吸附劑納米TiO2與BSA之間通過氫鍵結合形成吸附層．與熱力學結果一致,ΔH＜40 kJ/mol,吸附過程屬于物理吸附．

(2)DTA-TG表征．為研究納米TiO2對BSA的吸附量以及兩者結合物的熱行為變化,進行了差熱-熱重法分析．納米TiO2與BSA結合的DTA-TG曲線如圖6所示．樣品的重量損失以及熱量變化主要有3個階段:第1階段在75～150℃之間,圖6b中這一段失重是由于吸附中殘留的水和醇等揮發所致,圖6a中吸熱峰的出現是因為水和醇大量氣化揮發引起;第2階段在180～360℃之間,圖6b中BSA的燃燒和分解導致了失重的發生,質量損失4．34%,而表1納米TiO2對BSA的吸附量為40．1 mg/g,占質量的4.01%,與第2階段質量損失基本相同．圖6a中出現的吸熱峰表明納米TiO2脫附BSA需要吸收熱量,與熱力學結果中納米TiO2吸附BSA釋放熱量吻合;第3階段在480～680℃之間,圖6a中吸熱峰的出現是由于納米TiO2由低溫變體向高溫變體的晶型轉變所引起,圖6b中伴隨的失重是因為表面基團消散所致．

3 結論

以基于脯氨酸仿生合成的納米TiO2吸附劑對BSA具有較好的吸附性能．納米TiO2吸附BSA為單分子層物理吸附,符合Langmuir模型．吸附過程受吸附質濃度控制,可用Lagergren擬一級動力學來描述．吸附過程為放熱,混亂度減小,分子有序性增加．通過FT-IR和DTA-TG對納米TiO2-BSA結合物的表征,進一步驗證了上述結論．為進一步研究仿生納米TiO2對蛋白質有機大分子吸附過程中物質傳輸及熱量交換等方面提供了依據．

[1] Y G Tao,Y Q Xu,J Pan,et al．Glycine assisted synthesis of flower-like TiO2hierarchical spheres and its application inphotocatalysis[J]．Materials Science&Engineering:B,2012,177(18):1 664-1 671．

[2] P Tartaj．Sub-100 nm TiO2mesocrystalline assemblies with mesopores:preparation,characterization,enzyme immobilization and photocatalytic properties[J]．Chemical Communications(Cambridge,England),2011,47(1):256-258．

[3] J E Park,I S Park,T S Bae,et al．Electrophoretic Deposition of Carbon Nanotubes over TiO2Nanotubes:Evaluation of Surface Properties and Biocompatibility[J]．Bioinorganic Chemistry And Applications,2014(2014):236-521．

[4] C Dumitriu,A B Stoian,I Titorencu,et al．Electrospun TiO2nanofibers decorated Ti substrate for biomedical application[J]．Materials Science&Engineering:C,2014,45:56-63．

[5] C K Lee．Fabrication,characterization and wear corrosion testing of bioactive hydroxyapatite/nano-TiO2composite coatings on anodic Ti-6Al-4 V substrate for biomedical applications[J]．Materials Science&Engineering:B,2012,177(11): 810-818．

[6] A Roguska,M Pisarek,M Andrzejczuk,et al．Characterization of a calcium phosphate-TiO2nanotube composite layer for biomedical applications[J]．Materials Science&Engineering:C,2011,31(5):906-914．

[7] 肖秀峰,梁建鶴,湯海貞,等．TiO2納米管陣列膜對牛血清白蛋白的吸附與脫附[J]．功能材料,2012,43(22):3 092-3 096．

[8] 高曉亞,文雯,宋志英,等．超聲作用下稀土離子對納米TiO2與牛血清白蛋白相互作用的影響[J]．物理化學學報, 2012,28(2):470-478．

[9] 郭明,嚴建偉,俞慶森,等．加替沙星與牛血清白蛋白的結合反應研究[J]．物理化學學報,2004,20(2):202-206．

[10]陶玉貴,劉任龍,張健,等．基于脯氨酸仿生合成納米TiO2對BSA的界面吸附表征[J]．化工新型材料,2014,42(5): 193-194,201．

The adsorption behavior of Bovine Serum Albumin onto Nano-TiO2biomimetic synthesis based on proline and bovine serum albumin

GONG Jian-long,YANG Liang-jun,ZHU Long-bao, LIU Ren-long,TAO Yu-gui,LIANG Min-dong
(College of Biological and Chemical Engineering,Anhui Polytechnic University,Wuhu 241000,China)

The adsorption behavior of bovine serum albumin(BSA)onto Nano-TiO2biomimetic synthesis based on Proline was investigated．Fourier transform infrared spectrophotometry(FT-IR)and Differential Thermal Analysis-Thermal Gravimetry(DTA-TG)were employed to interface characterization．The results showed that fitting curve of isotherm adsorption accorded with Langmuir adsorption model,and the adsorption was monomolecular layer adsorption,and the maximum adsorption capacity was 40．1 mg/g and adsorption constant was 5．71 m L/mg．the adsorption process can be described by Lagergren pseudo-first-order kinetic model,belonging to an exothermic physical adsorption．Interface characterization showed that the interaction between Nano-TiO2and BSA was hydrogen bond and Vander Waals which conforms to the results of analysis of fitting curves．

Nano-TiO2;bovine serum albumin;adsorption behavior;adsorption kinetics

O614．41

A

1672-2477(2015)04-0007-05

2015-04-01

安徽省自然科學基金資助項目(1308085MC51);安徽省高校自然科學基金資助項目(KJ2012A034);安徽省高校青年科研基金資助項目(2003JQL370);國家級大學生創新創業訓練計劃基金資助項目(201410363023)

宮建龍(1969-),男,安徽含山人,講師,博士．