粘桿菌素流加補糖發酵工藝研究

李為全,王 洲

(1．安徽省皖北藥業股份有限公司,安徽宿州 234000; 2．安徽工程大學生物與化學工程學院,安徽蕪湖 241000)

粘桿菌素流加補糖發酵工藝研究

李為全1,王 洲2

(1．安徽省皖北藥業股份有限公司,安徽宿州 234000; 2．安徽工程大學生物與化學工程學院,安徽蕪湖 241000)

粘桿菌素發酵老工藝發酵周期短,發酵單位比較低．研究了流加補糖新工藝,通過發酵過程流加葡萄糖,解除了物料濃度過高抑制粘桿菌素合成速率的問題．同時結合對發酵接種量、培養溫度等參數的優化,使粘桿菌素發酵單位由110 000 U/m L提高至520 000 U/m L,并把該工藝成功地運用到生產中．

粘桿菌素;流加補料;發酵

粘桿菌素是由多粘類芽胞桿菌(Bacilluspolymgxa)產生、多種氨基酸和脂肪酸組成的一種堿性多肽類抗生素,對革蘭氏陰性桿菌有強烈的殺菌作用．由于粘桿菌素具有較好抗菌譜和高效(大多數菌株最小抑菌濃度＜6．25 ug/m L)、低毒、殘留少的特性,已經被廣泛應用于養殖畜牧業[1-2]．

粘桿菌素發酵老工藝一般采取37℃高溫培養的方式．由于培養溫度比較高,發酵過程菌體衰老較快,導致發酵周期一般較短;發酵老工藝采取基礎料一次性加入,發酵基礎物料濃度比較高,消毒過程不好控制,特別是對淀粉的液化程度的控制不好把握,淀粉的濃度高,發酵過程菌體的代謝速率慢,發酵過程起步效價相對較低,每天單位增幅小,發酵結束時由于菌體的活力減弱,料液中殘留的糖濃度高,料液粘稠,提取難度大,提取出的產品純度達不到高端客戶的需求．為解決這個問題,對老的發酵工藝進行了優化．主要思路是通過發酵基礎配方的調整,降低了發酵基礎配方中碳源的濃度;采取發酵過程流加補入葡萄糖的方式[3-4],提高了發酵過程生物合成速率;通過對發酵接種量、培養溫度的優化,提高了發酵起步效價和延長了生產合成周期,提高了發酵放罐時的產物濃度;放罐發酵液中產物濃度的提高非常有利于提取產品質量的提高和成本的降低．該工藝已被應用于實際生產中,提高了產品的競爭力．

1 材料和方法

1．1 菌株來源

出發菌株sy-7,由安徽省皖北藥業股份有限公司保存使用．搖瓶發酵生產能力測定平均效價為76 000 U/m L．

1．2 培養基

斜面培養基(g/L):葡萄糖5、KH2PO41、蛋白胨1．5、酵母膏1、瓊脂20,p H 7．0．

種子培養基(g/L):葡萄糖20、蛋白胨4、酵母膏1、NaCl 2、CaCO34,p H 7．0～7．2．

發酵培養基(g/L):淀粉濃度20、蛋白胨30、(NH4)2SO410、小麥胚芽粉15、NaCl 10、KH2PO40．6、CaCO36,p H 6．5～6．8．

葡萄糖液濃度:50%．

1．3 分析方法

發酵效價測定:發酵液經12 000 r/min離心10 min,取上清液采用HLPC測定粘桿菌素含量[5]．菌體形態檢查:美蘭染色,光學顯微鏡觀察法．總糖及還原糖的檢測:蒽酮比色法[6]．游離氨基氮的檢測:甲醛氧化測定[6]．

1．4 培養方法

培養條件:斜面、搖瓶種子及發酵培養,溫度33℃;斜面培養周期3 d,種子培養周期28 h;搖瓶發酵裝液量100 m L/500 m L,轉速220 r/min,發酵周期48 h．不補料50 L罐發酵37℃培養48 h,補料50 L罐發酵33℃培養96 h．

流加補糖發酵工藝:流加補糖發酵培養溫度經試驗摸索采用33℃培養,發酵周期為4 d．發酵過程流加補入葡萄糖液,采用蠕動泵壓入．

補糖速率:根據發酵液殘糖的濃度,控制補入糖液;通過氨水自控補入,控制p H 6．0±0．05．

2 結果與討論

2．1 流加補糖速率控制及發酵過程還原糖濃度控制

老工藝發酵過程不補料,新工藝發酵采取流加補糖工藝．發酵接種后,開始流加補入葡萄糖,每12 h補入液糖速率為發酵初始體積的2%,8 h后隨著菌量增加,逐漸提高補糖速率,20 h后隨著菌體濃度增大,逐漸進入生產期,每12 h補糖速率控制在3．6%,30 h后補糖速率達到最大;30～70 h,每12 h補糖速率在3．8%;70～90 h糖耗速率逐漸降低,相應降低補糖速率．發酵過程根據發酵液總糖質量濃度,適量調整補糖速率,一般控制發酵液總糖質量濃度為0．3～2．0 g/100m L范圍比較好．

新、老工藝發酵過程總糖含量的變化如圖1所示．由圖1可以看出,老工藝發酵初始總糖為13%,發酵過程中糖質量濃度逐漸下降,放罐時總糖質量濃度為4%,比較高,不利于提取,造成浪費;流加補糖工藝發酵過程總糖質量濃度在0．5%～2．5%之間,放罐時殘糖濃度比較低,有利于提取,同時也有利于減輕環保處理的壓力．

2．2 接種量對發酵過程的影響

老工藝和新工藝30 h起步效價比較如圖2所示．由圖2可以看出,不補糖粘桿菌素發酵工藝,接種量為1．0%,比較小,前期發酵起步效價比較低,發酵30 h發酵起步效價只能夠達到40 000 U/m L左右．采取流加補糖發酵工藝后,優化了發酵接種量工藝,通過研究發現增大發酵接種量可以明顯提高發酵起步效價和中期前的生物合成速率．通過小試罐工藝摸索確定發酵接種量為3%～5%,發酵起步效價比較高,發酵30 h起步效價可以達到100 000 U/m L．

2．3 發酵培養溫度的優化及發酵周期的變化

老的生產工藝發酵培養基淀粉濃度高,菌體的代謝速率比較低,發酵培養溫度為37℃,發酵周期為40～60 h,發酵周期比較短．采取流加補糖工藝后,降低了基礎料淀粉的濃度,解除了基質的抑制．在搖瓶中考察了不同培養溫度31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃對產量的影響,結果如圖3所示．由圖3可以看出,該菌種33℃下發酵單位最高,降低了發酵培養溫度,采取33℃培養,菌體衰老變慢,菌體形態比較好,粘桿菌素的旺盛合成期明顯延長,整個發酵周期得到延長．發酵過程由于采取流加補糖,使發酵液殘糖處于菌體代謝的最適狀態,滿足了菌體代謝需要,增大了發酵體積,發酵產量明顯提升．

2．4 不同發酵工藝粘桿菌素發酵單位比較

老工藝和新工藝發酵單位變化趨勢如圖4所示．不補料的老工藝基礎料淀粉質量濃度為13%,一次性投入,淀粉濃度高,還原糖濃度高,發酵中、前期易產生高濃度基質,抑制菌體生長和影響發酵過程粘桿菌素生物合成的啟動．從圖4可以看出,發酵30 h效價為44 000 U/m L,發酵48 h發酵單位達到約115 500 U/m L,發酵周期延長后單位不再增加,發酵單位比較低．流加補糖新工藝采取基礎料加入少量淀粉,發酵過程根據菌體代謝速率流加補糖,滿足菌體的代謝需求．發酵過程由于糖濃度可以控制在最適的范圍,促進了菌體的代謝速率,過程合成速率明顯提高．發酵30 h發酵單位達到100 000 U/m L,發酵60 h發酵單位達到420 000 U/m L,發酵96 h發酵單位達到520 000 U/m L．發酵80 h后發酵單位增幅明顯變小,因此最佳發酵周期為4 d．

3 結論

以50 L發酵罐進行粘桿菌素發酵工藝研究．粘桿菌素老的生產工藝,發酵基礎料中淀粉一次性加入,發酵過程不補糖,接種量比較小,培養溫度37℃,發酵周期為48 h,比較短,放罐效價低,生產上發酵單位只能達到110 000 U/m L,提取生產成本高,產品的質量不高．而流量補糖發酵工藝,通過對發酵基礎配方、流加補糖、培養溫度、接種量進行了系統研究,發酵4 d,發酵單位達到520 000 U/m L,提高了粘桿菌素的發酵生產水平,降低了生產成本．

[1] 賴濱霞．粘桿菌素高產菌株的選育[J]．福建畜牧獸醫,2010,32(6):19-20．

[2] 李德培．抗革蘭氏陰性菌促長藥物-粘桿菌素[J]．獸藥與飼料添加劑,1999,4(1):21-24．

[3] 丁煜．用分批補加培養基研究林可霉素生物合成工藝[J]．國外醫藥抗生素分冊,1996,17(1):21-23．

[4] 李繼安,林惠敏,牛金剛,等．流加補料技術在林可霉素發酵中的應用[J]．中國醫藥工業雜志,2012,43(9):739-740．

[5] 國家藥典委員會．中華人民共和國藥典[M]．北京:中國醫藥科技出版社,2000．

[6] 王秀奇,秦淑媛,高天慧,等．基礎生物化學實驗[M]．北京:高等教育出版社,2005．

Study on fermentation process of colistin by flow feed in sugar

LI Wei-quan1,WANG Zhou2
(1．Wan Bei Pharmaceutical Co．Ltd．,Suzhou 234000,China; 2．College of Biological and Chemical Engineering,Anhui Polytechnic University,Wuhu 241000,China)

The old fermentation process of colistin has the disadvantages of short fermentation period and low fermentation unit．This paper developed a new sugar supplement test for colistin and studied the fed sugar fermentation process of colistin．By using fed glucose fermentation process,the inhibition of colistin synthesis rate due to the high glucose concentration can be relieved．Combined with the optimization of fermentation inoculum and culture temperature parameter,the colistin fermentation unit can go up from 110 000 U/m L to 520 000 U/m L．And this technology has been successfully applied to large-scale production．

colistin;flow feeding;fermentation

Q815

A

1672-2477(2015)04-0017-03

2015-02-16

李為全(1975-),男,安徽宿州人,工程師,碩士．