分光光度法測定蝦青素

張泳,厲妙沙,吳嘉圣

(上虞新和成生物化工有限公司,浙江上虞312369)

分光光度法測定蝦青素

張泳,厲妙沙,吳嘉圣

(上虞新和成生物化工有限公司,浙江上虞312369)

建立一種快速測定化學合成蝦青素含量的分光光度分析方法。采用經氫醌處理的三氯甲烷做為提取溶液,在489 nm波長下測定吸光度,該分光光度法的標準曲線回歸系數是0.9999,相對標準偏差為0.36%,加標回收率為99.8%～102.5%,表明該分析方法準確性高、重復性好,且簡便、快速,可以作為企業大批量生產中蝦青素的測定方法。

蝦青素;分光光度法;化學合成

0 概述

蝦青素是一種廣泛存在于生物體的非維生素A源類胡蘿卜素。在水生動物蝦、蟹、魚和鳥類的羽毛中發揮調節色素沉積并顯色的作用。蝦青素被廣泛應用于魚蝦等水產養殖動物的飼料添加劑,以補充人體內蝦青素的缺乏。蝦青素是類胡蘿卜素合成的最高級別產物,具有明顯的抗氧化、消除活性單線態氧的作用。因此在食品、化妝品、保健品領域也有著廣泛的應用前景[1]。

從動植物及菌類中提取的蝦青素,由于其蝦青素含量較低及檢測限值低的原因,基本采用液相色譜分析法。而目前市場上魚飼料中的蝦青素90%是化學合成得到,國內尚未見有系統的對化工合成的蝦青素含量檢測的研究報道。本文研究參考國外對蝦青素理化性質的報道,采用紫外分光光度法對化學合成蝦青素的含量進行檢測,結果滿意可行。

1 實驗部分

1.1 實驗原理

蝦青素是由四個異戊二烯單位以共扼雙鍵形式鏈接,兩端又有兩個異戊二烯單位組成六節環結構的化合物,蝦青素分子結構中的這種共扼雙鍵體系及離域化的π電子,在可見光區表現出強吸收帶,且每種類胡蘿卜素分子的最大吸收峰位置與紫外可見光光譜的精細結構都是具有特征性的。由于類胡蘿卜素分子的這種光吸收性質,溶液中的類胡蘿卜素一般服從beer-lambert定律,所以通過分光光度法可以實現對蝦青素精確的定量分析[2]。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 實驗儀器

UV8500雙光束紫外分光光度計(無錫科達儀器廠)

電子天平(賽多利斯科學儀器(北京)有限公司)

超聲波清洗器(杭州科博儀器有限公司)

恒溫水浴裝置(金壇市科析儀器有限公司)

離心機

氮氣吹干

石英比色皿

1.2.2 試劑

(1)BHT(2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚,分析純)

(2)三氯甲烷(分析純,浙江杭州雙林化工試劑廠)

(3)二氯甲烷(分析純)

(4)碳酸氫鈉(工業級)

(5)氫醌(工業級)

(6)硫代硫酸鈉(分析純)

(7)三氯甲烷處理方法:

分別稱取0.1 g碳酸氫鈉、硫代硫酸鈉、氫醌和BHT置于500mL的棕色容量瓶,加入三氯甲烷至刻度,搖勻超聲30 min后過濾待用。

(8)試驗溶液:

準確稱取蝦青素樣品40mg(準確至0.0002 g),置于250mL的棕色容量瓶,加入10mg BHT,加入50mL二氯甲烷溶解,在熱水浴中超聲5min,流水冷卻至室溫;再加入100 mL三氯甲烷繼續超聲5min溶解,冷卻至室溫,然后用三氯甲烷稀釋至刻度,搖勻,即為待測溶液。

1.3 實驗方法

1.3.1 工作曲線的繪制

精密稱取待測蝦青素溶液適量,用三氯甲烷溶劑溶解,配置成濃度為1.0μg/mL、2.0μg/mL、3.0μg/mL、4.0μg/mL、5.0μg/mL、6.0μg/mL的系列標準溶液,用UV8500紫外分光光度計測定不同波長下的吸光度。在最大波長下,以三氯甲烷試劑空白調零,測定吸光度。以蝦青素標準溶液的濃度為橫坐標,對應吸光度值為縱坐標進行線性回歸、繪制標準工作曲線,見圖1。得到回歸方程式:y=0.1686x+0.075(R2=0.9999)

圖1 分光光度法的蝦青素標準

1.3.2 實驗步驟

準確移取待測溶液A 1.0 mL于50 mL棕色容量瓶中,用處理過的三氯甲烷(三氯甲烷加0.02%氫醌振搖后過濾)稀釋至刻度,搖勻,得溶液B。準確移取試驗溶液1.0mL于50mL棕色容量瓶中,用處理后的三氯甲烷稀釋至刻度,搖勻。

用紫外—可見光分光光度計測定溶液B在波長489 nm處的吸光度(1 cm石英比色皿)。以處理后的三氯甲烷為空白對照。

計算:

式中:

X——樣品中蝦青素百分含量;

A489——樣品溶液在489nm處測得的吸光度;

M——稱取樣品的質量,g;

12500——樣品的稀釋倍數;

1975——蝦青素的百分吸收系數(E1cm1%)。

誤差要求:平衡測定二次,相對偏差不超過1.0%,結果以算術平均值表示。

2 結果與討論

2.1波長的選擇

稱取待測蝦青素試驗溶液適量,用三氯甲烷溶劑稀釋成濃度為1μg/mL的標準溶液,在350～600 nm波長范圍使用UV8500雙光束紫外分光光度計進行光譜掃描,得到吸收光譜圖見圖2。由圖2可知,蝦青素在489 nm處有最大吸收。由此分光光度法檢測波長選擇489 nm。

圖2 蝦青素標準溶液的吸收光譜圖(三氯甲烷)

2.2 精密度試驗

精密稱取待測蝦青素試驗溶液1.0mL于50mL棕色容量瓶中,用經處理的三氯甲烷稀釋至刻度,搖勻。取待測溶液放入1 cm光徑比色皿中,用UV8500紫外分光光度計測定蝦青素溶液在489 nm波長處的吸光度值,連續測定6次,計算相對標準偏差RSD=0.36%。

表1 精密度試驗結果

2.3 穩定性試驗

本實驗對蝦青素標準樣品的穩定性進行了研究。取待測蝦青素溶液各兩份,一份暴露在自然條件下,另一份充氮密封并避光保存在-18℃的冰箱中。暴露于自然條件下的樣品每隔1 h測一次,而冰箱保存的樣品每隔1 d測一次。分別按照分光光度法檢測吸光度。

試驗結果表明,蝦青素樣品在自然條件下,2 h后樣品含量開始有明顯的減少,而在冰箱保存條件下3 d后開始出現減少現象。

這是由于蝦青素分子中的多烯鏈導致其具有極大的不穩定性,對光敏感,在光照下易被破壞,很容易被空氣中的氧或過氧化物氧化,易受溫度、氧化及光照影響而發生降解。如蝦青素標準溶液在自然狀態下2 h內濃度明顯下降。所以對蝦青素檢測分析樣品的最佳保存時間是3 d,并且應避光低溫保存,試驗操作需要盡快完成且盡可能避光操作,操作過程應盡量減少氧氣接觸機會,控制操作溫度,采用40℃下抽真空旋轉蒸發濃縮或氮氣吹干,不能空氣吹干。樣品的超聲浴溫度不要超過35℃,同時添加2,6-二叔丁基對甲酚(BHT)作為穩定劑。

2.4 回收率試驗

按待測蝦青素溶液濃度的75%、100%和125%制備蝦青素溶液,各3份,分別測定吸光度。分別加入濃度為100μg/mL蝦青素標準溶液1mL、2 mL、3mL用紫外分光光度計測定吸光度值,計算蝦青素平均回收率,測得回收率是99.8%～102.5%,結果見表2。

2.5 測定

表3分別是分光光度法和液相色譜法得到的最終蝦青素的百分含量,可以看出,分光光度法和液相色譜法檢測得到的含量值基本無差異。

表2 回收率測定結果

表3 不同方法得到的蝦青素含量

3 結論

本文研究利用蝦青素不溶于水,易溶于有機溶劑的特點,將蝦青素標準樣品經加有0.02%氫醌處理的三氯甲烷提取、稀釋12500倍后,在489 nm波長下利用分光光度法對蝦青素含量進行測定,其標準曲線的回歸方程的r2超過了0.99,線性良好,能用于定量分析測定。分光光度法測定蝦青素化學合成品,回收率99.8%～102.5%,相對標準偏差RSD值0.36%;其線性關系好,靈敏度較好,且操作簡便、快速、經濟,特別適用企業大批量生產蝦青素情況下進行測定。

[1]Miki W.Biological functions and activities of animal carotenoids[J].Pure&Appl Chem,1991,63:141-146.

[2]惠伯隸.類胡蘿卜素化學及生物化學[M].北京:中國輕工業出版社,2005.

[3]Sedmark J J,Weeradinghe D K,Jolly SO.Extraction and quantitation of astaxanthin from phaffia rhodzyma[J]. Biotechnol tech,1990,4(2):107-112.

[4]Pilar Calo,Jorge B Velazquez,Carmen Sieiro,et al.Analysis of astaxanthin and other carotenoids from several phaffia rhodzymamutants[J].JAgric Food Chem,1995,43:1396-1399.

Analysis of Astaxathin by Spectrophotometry

ZHANG Yong，LIMiao-sha，WU Jia-sheng
(Shangyu NHU Biochemical Co.,Ltd.,Shangyu,Zhejiang 312369,China)

Establish a rapid determination of an analytical assay of astaxathin were desgned from chemical synthesis by spectrophotometry.Using chloroform as extraction solution treated by hydroquinone,under 489nm wavelength determination of absorption.The spectrophotometric method of standard curve regression coefficient is 0.9999.the relative standard deviation is 0.36%,the standard addition recovery is 99.8%～102.5%,show that the analysismethod of high accuracy,good repeatability,and is simple,rapid,and can be used as an enterprise with the determ ination of astaxanthin in mass production.

spectrophotometry;astaxathin;chemical synthesis

1006-4184(2015)9-0051-04

2015-07-15

張泳(1981-),男,浙江紹興人,在讀碩士研究生,主要研究方向:化工分析技術。

*通訊作者:吳嘉圣(1984-),男,工程師,浙江紹興人,從事精細有機合成研究及相關技術管理工作。E-mail:shengjiawu@163.com。