不同來源乳酸菌對2種致病菌的抑菌活性比較及抑菌性質研究*

任大勇 榮鳳君 宮圣潔 張振業 朱劍威 劉宏妍 于寒松

1（吉林農業大學食品科學與工程學院，吉林長春130118）2（吉林農業大學中藥材學院，吉林長春130118）

不同來源乳酸菌對2種致病菌的抑菌活性比較及抑菌性質研究*

任大勇1**榮鳳君1宮圣潔1張振業1朱劍威1劉宏妍2于寒松1

1（吉林農業大學食品科學與工程學院，吉林長春130118）2（吉林農業大學中藥材學院，吉林長春130118）

乳酸菌是指發酵糖類主要產物為乳酸的一類革蘭氏陽性菌，不產生芽孢，過氧化氫酶陰性細菌的總稱。乳酸菌是益生菌的重要組成部分，擔負著機體多種重要的生理功能，并在腸道內發揮益生功能，增強機體的免疫力和抵抗力，促進腸道的生長和發育，是廣泛應用的益生菌之一。乳酸菌以其獨特的生物學功能呈現出極大的開發、利用價值，在農業、工業、食品及醫療保健等與人類密切相關的領域中有很高的應用價值。沙門氏菌、金黃色葡萄球菌能引起食物中毒和食品污染，是食源性疾病的常見細菌，這一問題得到了廣泛關注。

抗生素給人類帶來巨大的經濟效益同時，在人的身體里也有耐藥性、抗藥性、殘留等副作用，影響了機體的微生態平衡。目前許多研究表明，乳酸菌能產生類似抗生素的物質，能有效抑制有害微生物的生長，增加胃腸道內有益微生物數量，有可能成為潛在的抗生素替代品。本試驗研究其對食品中常見致病菌的抑制作用，最終篩選出抑菌效果較好的乳酸菌菌株。

1 材料與方法

1.1 乳酸菌菌株來源

本試驗乳酸菌菌株來源如表1所示。

表1 乳酸菌菌株來源

以上菌種由吉林農業大學食品科學與工程學院毒理學實驗室分離并保存。

1.2 致病菌菌株

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium），由吉林農業大學食品科學與工程學院毒理學試驗室分離并保存。

1.3 試驗試劑

MRS液體培養基：蛋白胨10.0 g、葡萄糖20.0 g、牛肉膏10.0 g、酵母膏5.0 g、吐溫-80 1.0 mL、磷酸氫二鉀2.0 g、檸檬酸氫二銨2.0g、乙酸鈉5.0g、硫酸鎂0.58 g、硫酸錳0.25 g、蒸餾水1 000 mL（加12.0 g瓊脂為固體培養基）。

BL培養基：胰蛋白胨10.0 g、酵母浸出物5.0 g、氯化鈉10.0 g、瓊脂9.0 g、蒸餾水1 000 mL。

氫氧化鈉，北京化工廠；過氧化氫酶，上海索萊寶生物科技有限公司；胰蛋白酶、胃蛋白酶，中國慧世生化試劑有限公司；青霉素；乳酸鏈球菌素（NiSin）。

1.4 試驗儀器

臺式離心機，上海安亭科學儀器廠制造；電熱恒溫培養箱，湖北省黃石市醫療器械廠；電子天平，上海佑科儀器表有限公司；Delta320 pH計，梅特勒托利多儀器(上海)有限公司；立式壓力蒸汽滅菌器，上海博迅實業有限公司醫療設備廠；KYC-100B空氣恒溫搖床，上海新苗醫療器械制造有限公司；凈化工作臺，上海新苗醫療器械制造有限公司；鑷子；牛津杯；10 mL離心管；1.5 mLEp管；培養皿。

1.5 試驗方法

1.5.1 上清液

取2 mL活化好的乳酸菌培養液，在4℃條件下，以12 000 r/min離心10 min，取上清液，進行抑菌試驗。取3 mL乳酸菌菌液以12 000 r/min離心10min后，取乳酸菌的上清液，在37℃水浴加熱2h后，用1 mol/L NaOH把菌株上清液的pH值調為6.5，然后用于抑菌試驗。

1.5.2 乳酸菌菌體的獲取

取4 mL活化好的乳酸菌菌液，以8 000 r/min離心2 min后，將上清液棄去，用蒸餾水洗滌1次，8 000 r/min離心2 min后，將上清液棄去，向剩余菌體中加入300 μL的蒸餾水吹勻，使濃度達到1×109cfu/mL，用于抑菌試驗。

1.5.3 超聲破碎菌體的獲取

取3 mL活化好的乳酸菌菌液，使濃度達到1×109cfu/mL，8 000 r/min離心2 min，將上清液棄去，剩余菌體用蒸餾水連續洗滌2次，8 000 r/min離心2 min，將上清液棄去，向剩余菌體中加入3 mL的蒸餾水吹勻，進行超聲波細胞破碎，破碎后離心取上清液，用于抑菌試驗。

1.5.4 陽性對照藥品

青霉素和乳酸鏈球菌素（NiSin）做陽性對照組。用質量濃度0.9%生理鹽水將病原菌稀釋至10-6cfu/mL濃度，取100 μL病原菌稀釋液接種于LB固體培養基上，并涂布均勻。用鑷子夾取高壓滅菌后的牛津杯放到LB培養基上，每個平板貼5～6個牛津杯，分別吸取100 μL乳酸菌上清液加于牛津杯中，在超凈工作臺中靜放5 min～10 min。靜放后將平板放于37℃恒溫培養箱培養12 h后，觀察是否有抑菌圈，及其直徑大小，從而比較各菌株菌體和產物的抑菌效果。

2 結果分析

9株乳酸菌對金黃色葡萄球菌和沙氏門菌的抑菌效果如表2所示。

表2 9株乳酸菌對2種致病菌的抑菌效果 cm

2.19 株乳酸菌對金黃色葡萄球菌的影響

由表2可知9株乳酸菌經過處理后對金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的抑菌圈直徑。乳酸菌上清液抑菌性最好的是H9，直徑是2.56 cm；抑菌效果弱的是T20，抑菌圈只有1.37 cm。當把上清液pH調到6.5時，只有L12處理后的菌液對金黃色葡萄球菌還有抑菌效果，抑菌直徑為1.26 cm，見下頁圖1。經過超聲波破碎后，還有抑菌性的菌株是H8、H9、L2抑菌效果幾乎差不多，其中最好的是L2菌株，抑菌圈直徑是1.27 cm；直徑最小的是T18，抑菌直徑為0.94 cm。把菌株經過2次PBS緩沖液洗滌之后，只有T18菌體對致病菌沒有抑菌效果，其余5株都有抑菌效果，抑菌效果最好的是H8，直徑為1.63 cm，見下頁圖2。

2.29 株乳酸菌對鼠傷寒沙門氏菌的影響

根據表2可知9株乳酸菌經過處理后對鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium）的抑菌圈直徑。T18、L16、L17乳酸菌菌株的上清液抑菌效果比較接近，直徑大約都在2.46 cm～2.54 cm左右；當把上清液pH調到6.5時，T18、L17、L34還有抑菌效果，抑菌性效果最強的是L17，抑菌直徑為1.47 cm，見下頁圖3；經超聲波破碎后，抑菌效果較好的菌株是L17，直徑是1.27 cm之間，見圖3；把9株乳酸菌進行PBS緩沖液洗滌2次之后，活菌體還具有抑菌效果，抑菌活性較好的是L16，抑菌圈的直徑是2.04 cm，見下頁圖4。

3 討論

在抗生素濫用的今天，尋找天然抗生素，已經成為人們研究的方向。天然抗生素在機體內不會殘留、產生耐藥和抗藥性，同時還可以抑制胃腸道內有害微生物的生長，保護機體的微生態平衡。試驗結果表明，不同家庭自制發酵食品中分離出的乳酸菌，其代謝產物、活菌體、超聲波裂解物對致病菌都有抑菌效果，不同菌株在不同條件下對致病菌的抑菌作用也不相同。

圖1 菌株L12對金黃色葡萄球菌抑菌圈

圖2 菌株H8對金黃色葡萄菌抑菌圈

圖3 菌株L17對鼠傷寒沙門氏菌抑菌圈

圖4 菌株L16對鼠傷寒沙門氏菌抑菌圈

目前，國內外有很多研究人員對乳酸菌的抑菌活性進行了研究。周偉等報道了植物乳桿菌素L-1對單核細胞增生李斯特菌作用機制的研究。魏新元等報道了3株食用乳酸菌對抗生素的藥敏性的研究。Sgouras D等報道了體外和體內抑制幽門螺旋桿菌的干酪乳桿菌菌株的活化的研究。侯亞文等報道了產細菌素乳酸菌篩選方法的研究進展的研究。陳靜等報道了泡菜中乳酸菌的分離及其發酵液抑菌活性研究。乳酸菌的抑菌效果體現在多方面，不同來源的乳酸菌產生抑菌效果的原因也不相同。乳酸菌代謝后的產物，如乙酸、過氧化氫、抗生素類或細菌素類物質都具有抑菌作用。

本試驗把9株乳酸菌上清液的pH值均調到6.5，菌液還具有抑菌效果，說明乳酸菌的代謝物中不只含有乳酸，還含有細菌素類物質進行抑菌；把乳酸菌菌體進行2次洗滌后，活菌體仍然具有抑菌效果，推測乳酸菌菌體表面有抑菌物質的存在；經超聲波裂解后還具有抑菌效果，推測菌體內部含有抑菌物質或菌體表面的抑菌物質經過超聲破碎、離心之后在上清液中產生抑菌效果。后續將會對細菌素類物質和活菌體進行深入研究，以期為今后乳酸菌的開發應用提供參考。

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Antibacterialproperties of lactic acid bacteria from different sources against two pathogens*

RENDayong1**RONGFengjun1GONGShengjie1ZHANGZhenye1ZHU Jianwei1LIUHongyan2YUHansong1

1（College of food science and engineering，Jilin agricultural university，Jilin Changchun 130118，China）

2（College ofChinese herbal medicine，Jilin agricultural university，Jilin Changchun 130118，China）

天然抗生素已經成為現代生物科學和食品科學關注的熱點，篩選出含有抑菌物質的天然抗生素菌株，已經成為食品、生物研究的新趨勢。選用9株不同來源的乳酸菌對2種致病菌進行體外抑菌試驗，采用牛津杯法對乳酸菌的上清液、上清液（pH=6.5）、超聲波裂解液、活菌體的抑菌性能進行研究。試驗結果表明，當致病菌為金黃色葡萄球菌時：上清液抑菌最好的菌株是H9，直徑為2.56 cm；上清液（pH=6.5）抑菌最好的是L12，直徑為1.26 cm；活菌體抑菌最好的菌株H8，直徑為1.63 cm；超聲波裂解液抑菌最好的是L2，直徑是1.27 cm。當致病菌為沙門氏菌時：上清液抑菌最好的菌株是L16，直徑為2.54 cm；上清液（pH=6.5）抑菌最好的是L17，直徑為1.47 cm；活菌體抑菌最好的菌株L17，直徑為1.27 cm；超聲波裂解液抑菌最好的是L16，直徑是2.04 cm。

乳酸菌；抑菌；牛津杯法；病原菌

Natural antibiotics have become a hot topic in modern biological science and food science,screening of the natural antibiotic strains containing antimicrobial substances is a new trend in food and biological research.9 strains of lactic acid bacteria from different sources for 2 kinds ofpathogenic bacteria in vitrobacteriostasis experiment was carried out.Oxford cup method was used to vitro antibacterial test in the supernatant of lactic acid bacteria,the supernatant（pH=6.5），the ultrasonic cracking and the live bacteria.The results show that pathogenic bacteria is Staphylococcus aureus,the best antibacterial strain of the supernatant,supernatant（pH=6.5），Live bacteria and Ultrasonic cracking liquid respectively is H9,L12,H8,L2.Above the best diameter respectively is 2.56 cm,1.26 cm,1.63 cm,1.27 cm. Pathogenic bacteria is Salmonella,the best antibacterial strain of the supernatant,supernatant（pH=6.5），Live bacteria and Ultrasonic cracking liquid respectively is L16,L17,L17,L16.Above the best diameter respectively is 2.54 cm,1.47 cm,1.27 cm,1.42 cm.

lactobacillus；antibacterial experiment；oxford cup method；pathogenic bacteria

TS261.1+7

A

1673-6044（2015）04-0041-04

10.3969/j.issn.1673-6044.2015.04.012

吉林省教育廳項目［吉教科合字（2015）第196號］。

**任大勇，男，1979年出生，2013年畢業于吉林大學食品安全專業，博士，副教授。

2015-10-10