左歸降糖益腎方含藥血漿對高糖培養小鼠足細胞凋亡及Caspase-12表達的影響

陳 聰，吳勇軍，喻 嶸*，唐 元，羅文娟，曾 婧，張 翔

（湖南中醫藥大學，湖南 長沙410208）

足細胞是糖尿病腎病 （Diabetic nephropathy，DN）發生發展的關鍵靶細胞之一，足細胞的損傷和剝脫，與DN 早期發病相關，明顯早于腎小球硬化和腎間質病變[1-2]。 細胞凋亡是足細胞丟失的重要原因之一。內質網應激凋亡信號分子Caspase-12 的活化與細胞凋亡密切相關[3-4]。 高糖環境是引起足細胞凋亡及（或）死亡的原因之一，其具體分子機制尚不清楚[4-5]。 課題組前期研究發現中藥復方左歸降糖益腎方可以改善糖尿病腎病MKR 鼠腎功能， 保護足細胞結構[6]。 本研究在前期研究基礎上，進一步探討經高糖處理體外足細胞后，足細胞損傷的可能分子機制，并為糖尿病腎病的靶向治療提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞培養 小鼠足細胞購自北京協和細胞中心（Mouse podocyte；3111C0001CCC000230）。 以含10%胎牛血清，90%的DMEM 完全培養基 （含100 U/mL 青 霉 素、100 μg/mL 鏈 霉 素、25 mmol/L葡萄糖）在5%CO2，37 ℃培養箱中培養。期間2～3 d更換培養液1 次，相差顯微鏡觀察細胞形態，待細胞體積明顯增大，向四周伸出足突分化成熟后用于實驗。

1.1.2 動物 Wistar 大鼠40 只，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司， 飼養于湖南中醫藥大學SPF級實驗動物中心，許可證號：SYXK(湘)2013-0005）。

1.1.3 主要試劑 總RNA 提取試劑盒， 購自天根生化科技有限公司；逆轉錄試劑盒，購自Fermentas公司；PCR 引物，由上海生工公司合成；葡萄糖（分析純），購自上海國藥集團化學試劑有限公司；兔抗小鼠Caspase-12 多克隆抗體，購自北京博奧森生物技術有限公司；Hoechst 33258 熒光染料， 購自合肥博美生物科技有限責任公司；AnnexinV-FITC 細胞凋亡檢測試劑盒，購自深圳欣博盛生物技術有限公司。

1.1.4 儀器 WD-9402 A 型PCR 擴增儀， 購自北京六一儀器廠；F1-F2 Fuses Type T2A 型化學發光凝膠成像分析系統， 購自Bio-Rad 公司；BioPhotometer plus 型核酸蛋白分析儀， 購自Eppendorf 公司；Aria2 型流式細胞檢測儀， 購自BD 公司；A1 型激光共聚焦顯微鏡，購自尼康公司。

1.1.5 含藥血漿制備 左歸降糖益腎方： 由熟地黃、黃芪、山藥等9 味藥組成(中藥湯劑制備：經水煎煮2 次， 混合， 濾過， 濃縮制備成含生藥濃度為2 g/mL 的藥液，經滅菌后置4 ℃冰箱中備用)。 大鼠按隨機原則分為空白組、左歸降糖益腎方組、內質網應激抑制劑4-苯基丁酸 （4-Phenylbutyric acid，4-PBA）組，每組10 只，連續7 d 灌胃給藥，1 次/d。按人與大鼠體表面積換算法計算給藥量，中藥給藥劑量為30 g/kg，相當于臨床人用劑量的3 倍，灌胃容量為15 mL/kg；4-PBA 生理鹽水稀釋， 濃度為0.20 g/mL，劑量為3 g/kg，灌胃容量為15 mL/kg；空白血漿采集于不給藥動物。 末次給藥后1 h 腹主動脈 插 管 取 血，7.5% EDTA·Na2抗 凝， 收 集 血 漿0.22 μm 濾膜過濾，56 ℃水浴滅活30 min 后，分裝置-20 ℃冰箱備用。

1.2 方法

用完全培養基調細胞密度為1×105/mL 的細胞懸液，然后轉種培養瓶中，加入含10%胎牛血清完全培養基總體積5 mL，放入5%CO2，37 ℃培養箱中培養至貼壁。用不含胎牛血清的DMEM 培養液同步化處理12 h 后，分為空白組(A 組)、高糖組(B 組)、左歸降糖益腎方含藥血漿組(C 組)、4-PBA 含藥血漿組(D 組)。 A 組為終濃度25 mmol/L 葡萄糖，含10%空白血漿的DMEM 培養基；B 組為終濃度200 mmol/L 葡萄糖， 含10%空白血漿的DMEM 培養基；C 組、D 組含藥血漿組，分別為10%含藥血漿，終濃度200 mmol/L 葡萄糖的DMEM 培養基。 根據課題組預實驗結果， 選擇在48 h 后收集細胞。 用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA 消化細胞， 加入完全培養基終止消化， 離心管收集細胞懸液，1 000 r/min，5 min 離心， 棄上清； 用PBS 洗滌細胞沉淀2～3 次，1 000 r/min，5 min 離心，棄上清；置冰上，用于Western blot，逆轉錄-聚合酶鏈反應等相關檢測。

1.2.1 逆轉錄-聚合酶鏈反應 用總RNA 提取試劑盒抽提其總RNA，采用核酸蛋白分析儀測定其濃度。 取1 μg 總RNA，隨后用逆轉錄試劑盒以Oligo（dT）為引物進行逆轉錄反應。 以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）為內參基因。 應用Primer 5.0 軟件，根據GenBank 中小鼠的序列設計引物。

Caspase-12： 上 游5’-TGGCCCATGAATCACATCTA-3’。

下游5’-TGTTGCAGATGATGAGAGCC -3’，產物183 bp。

GAPDH： 上 游5’-ACTTGAAGGGTGGAGCCAAA-3’。

下游5’-CCAGGAAATGAGCTTGACA-3’， 產物608bp。

Caspase-12： 預變性，94 ℃，10 min；94 ℃變性40 s，51.5 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共32個循環； 最后72 ℃延伸7 min。 GAPDH： 預變性，95 ℃，5 min；94 ℃變 性30 s，60 ℃退 火30 s，72 ℃延伸30 s， 共28個循環； 最后72 ℃延伸10 min。 PCR 產物進行1.2%瓊脂糖凝膠電泳，Bio-Rad 化學發光凝膠成像分析系統分析電泳條帶光密度值，以Caspase-12 和GAPDH 電泳條帶光密度值比值計算Caspase-12 mRNA 相對表達量。實驗重復三次，取均值。

1.2.2 蛋白質印跡法 按試劑盒操作提取總蛋白，蛋白樣品100 ℃變性10 min 后， 用50 μg 蛋白樣品電泳，濃縮膠電壓80 V，分離膠電壓120 V。電泳結束后轉膜90 min， 將轉有蛋白的膜置于5%脫脂奶粉中封閉（用TBST 稀釋奶粉），4 ℃過夜，不洗，置于兔抗小鼠Caspase-12 多克隆一抗(1∶500，TBST稀釋)中孵育2 h，TBST 洗3 次，每次10 min，加入辣根過氧化物酶山羊抗兔二抗(1∶1000，TBST 稀釋)，室溫孵育1～2 h，TBST 洗3 次，每次10 min。 加入ECL 化學發光試劑，Bio-Rad 化學發光凝膠成像分析系統以目的條帶光密度值與同個樣品的GAPDH（GAPDH 內參1∶2000，用TBST 稀釋）光密度值的比值表示目的基因蛋白表達水平。 實驗重復3 次，取均值。

1.2.3 流式細胞術 收集細胞， 調細胞密度為1×106/mL， 按AnnexinV-FITC 細胞凋亡檢測試劑盒說明書操作，由專業人員按流式細胞檢測儀操作步驟檢查。 實驗重復3 次，取均值，足細胞總凋亡率=早期凋亡率+中晚期凋亡率。

1.2.4 免疫熒光細胞化學法 在無菌狀態下，將防脫蓋玻片分別放入6 孔培養板中。 每孔均勻加入含細胞1×105/mL 的完全培養基懸液1 mL， 放入CO2培養箱中培養至貼壁。用不含胎牛血清的DMEM 培養基同步化處理12 h 后， 分為A 組、B 組、C 組、D組。 分別加入相應培養基，48 h 后收集細胞，用PBS洗滌5 min，3 次， 加入4%多聚甲醛固定 （25～30 min），PBS 洗滌5～10 min，3 次。 用1%曲拉通X-100（PBS 配制）打孔，2～5 min，PBS 洗3 次，每次5～10 min。Hoechst 33258 染核（1∶400，PBS 稀釋），室溫放置15 min，PBS 洗3 次，每次10 min，晾干，抗熒光淬滅封片劑封片，激光共聚焦顯微鏡下拍片。

1.3 統計學分析

數據滿足正態性及方差齊性檢驗，采用單因素方差分析；若不滿足，則采用非參數檢驗(Kruskal-Wallis 檢驗)，P＜0.05 為差異有統計學意義。 使用SPSS 17.0 統計軟件處理，結果以“±s”表示。

2 結果

2.1 足細胞觀察情況

A 組細胞核呈較均勻的藍色熒光， 核仁較清晰；B 組凋亡細胞核呈致密濃染， 或呈碎塊狀致密濃染。C 組與D 組細胞凋亡情況較B 組改善。見第72 頁彩圖圖1。

2.2 各組凋亡率比較

流式細胞儀檢測將各組細胞分為4個細胞亞群：正常存活細胞(左下象限，Q3)，早期凋亡細胞(右下象限，Q4)，中晚期凋亡細胞(右上象限，Q2)，壞死細胞(左上象限，Q1)。 與A 組比，B 組足細胞凋亡率明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.05）；與B 組比，C 組與D 組足細胞凋亡率明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.05）；與C 組比較，D 組凋亡率降低，差異有統計學意義（P＜0.05）。 見表1，圖2。

表1 足細胞凋亡率的變化 （±s，n=3）

表1 足細胞凋亡率的變化 （±s，n=3）

注：與A 組比較▲P＜0.05；與B 組比較★P＜0.05；與C 組比較■P＜0.05。 下表同。

組別A 組B 組C 組D 組足細胞凋亡率（%）9.80±1.28 39.77±2.51▲18.27±1.07▲★11.00±1.28★■

2.3 各組Caspase-12 表達的比較

Western blot 及RT-PCR 法顯示： 與A 組比，B組足細胞Caspase-12 蛋白及mRNA 的表達水平明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.05）；與B 組比，C組與D 組Caspase-12 蛋白及mRNA 表達水平均明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.05）；但C 組與D組比較，Caspase-12 蛋白及mRNA 表達水平， 差異均無統計學意義（P＞0.05）。 見表2，圖3。

表2 各組Caspase-12 蛋白、mRNA 表達的比較 （±s，n=3）

表2 各組Caspase-12 蛋白、mRNA 表達的比較 （±s，n=3）

組別A 組B 組C 組D 組Caspase-12 蛋白/GAPDH 0.54±0.06 1.23±0.12▲0.84±0.16▲★0.86±0.11▲★Caspase-12 mRNA/GAPDH 0.35±0.02 0.83±0.04▲0.58±0.10▲★0.55±0.12▲★

3 討論

圖2 AnnexinV-FITC／PI 雙染法檢測不同組足細胞凋亡

圖3 各組Caspase-12 蛋白及mRNA 的表達水平變化

糖尿病腎病（DN）是糖尿病全身微血管病變的腎臟表現，也是糖尿病的主要死亡原因之一，已成為導致終末期腎衰竭的第二病因，僅次于腎小球腎炎[7-8]。 足細胞是糖尿病腎病發生、發展的關鍵靶細胞之一。 細胞凋亡是導致足細胞丟失的重要因素[9]。內質網應激 （ERS） 是一種新的引起細胞凋亡的途徑， 也是造成DN 腎組織足細胞損傷的重要機制之一[10-11]。 Caspase-12 家族是內質網應激過程中最終執行凋亡的水解酶類。 Caspase-12 位于內質網膜，與其他的Caspases 一樣以無活性的酶原形式存在。ERS 引起Caspase-12 激活，而死亡受體或線粒體凋亡途徑中Caspase-12 不被活化。激活的Caspase-12切割并激活Caspase-9，活化的Caspase-9 激活Caspase-3 等效應Caspases，導致細胞凋亡[3]。Cao Y 等[4]研究發現高劑量D-葡萄糖分別刺激體外小鼠足細胞后，Caspase-12 蛋白或mRNA 的表達水平在48 h達高峰，并與足細胞凋亡率正相關。

本實驗用葡萄糖200 mmol/L 體外處理足細胞48 h 后，發現與正常葡萄糖組比：足細胞凋亡率升高，Caspase-12 蛋白及mRNA 的表達水平升高。 證實高糖是造成足細胞凋亡的原因之一，足細胞凋亡的分子機制之一是Caspase-12 蛋白及mRNA 的表達水平升高。 經左歸降糖益腎方含藥血漿干預后，足細胞凋亡率，Caspase-12 蛋白及mRNA 的表達水平較高糖組明顯降低。 同時，與陽性對照4-PBA 含藥血漿組比較， 在降低Caspase-12 蛋白及mRNA的表達水平方面，具有相似的作用。

DN 的中醫病機課題組認為： 主要病理機制為氣陰兩虛，夾熱毒瘀血。 治療上，針對糖尿病腎病的“虛、毒、瘀”病機，采用標本兼治的方法，補脾益腎、滋陰益氣以治本，解毒活血以治標。 左歸降糖益腎方由熟地、黃芪、丹參、玉米須等組成，方中重用熟地滋陰養腎為主藥，以填真陰；黃芪等益氣健脾；丹參活血化瘀；玉米須等清熱利濕，利尿消腫；諸藥合用，共奏滋陰益氣，活血解毒，利尿消腫之功效。 課題組前期研究表明滋陰益氣、 健脾固腎以扶正固本，活血解毒以治標實，可改善或解除炎癥因子、氧化應激、脂質代謝障礙、內質網應激等賴以產生和發展的條件，延緩糖尿病腎病的發生發展[6，12-14]。 本實驗發現左歸降糖益腎方含藥血漿可以通過降低高糖誘導的內質網凋亡因子Caspase-12 蛋白及mRNA 的表達水平，降低足細胞凋亡率，從而保護足細胞。 而目前，DN 的發病機制復雜，尚未完全闡明， 中醫藥在DN 的治療方面進行了諸多有益的探索，療效肯定。 因而，左歸降糖益腎方含藥血漿在其他方面的治療作用值得進一步研究。

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