益心泰顆粒對慢性心力衰竭兔Ca2+-CaN-NFAT3信號通路的影響

郭志華，吳剛強，李 雅*，唐 云，毛湘屏，王月愛，孫 濤

（1.湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南 長沙410007；2.湖南中醫藥大學藥學院，湖南 長沙410208；3.湖南中醫藥大學第二附屬醫院，湖南 長沙410005）

心肌重構是慢性心力衰竭 （chronic heart failure，CHF）發生的基本病理機制[1]。 近年來大量研究顯示，Ca2+-CaN-NFAT3信號通路在各種原因導致的病理性心肌肥大、心肌重構和心衰的發生發展過程中發揮著重要作用[2]。 中醫對心衰的病機有深刻的認識，認為其總病機為本虛標實，病理基礎是心氣、心陽虛，標實為血瘀、水飲[3]。 基于此理論，創建益心泰顆粒。 前期研究結果顯示，益心泰可改善CHF 大鼠心肌重構，提高心功能[4]。但益心泰改善CHF 心機重構的機制尚不清楚，本研究采用阿霉素耳緣靜脈注射致CHF 兔模型， 從Ca2+-CaN-NFAT3信號通路入手， 深入探討益心泰顆粒對CHF 的作用機制，為益心泰顆粒的臨床推廣應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 成年健康普通級新西蘭兔150 只，雌雄各半，體質量1.7～2.0 kg，由長沙市天勤生物技術有限公司提供，許可證號：SCXK（湘）2009-0012。

1.1.2 主要藥物及試劑 益心泰顆粒(由黃芪、丹參、紅花、澤瀉、豬苓等組成)，由湖南中醫藥大學第一附屬醫院藥劑科提供， 每克益心泰顆粒含生藥3.1 g；氯沙坦鉀：50 mg/片，由杭州默沙東制藥有限公司生產；鹽酸阿霉素：10 mg/瓶，由深圳萬樂藥業有限公司生產。鈣（Ca）測試盒（批號：C004-2）、鈣調神經磷酸酶（CaN）測試盒（批號：A068）：由南京建成生物工程研究所提供；NFAT3 抗體（批號：2183）、PNFAT3 抗體（批號：sc-68704）：由Santa cruz 公司提供。

1.1.3 實驗儀器 電子天平TP-2200B （湘儀天平儀器設備有限公司）；IE33 彩色多普勒超聲診斷儀（荷蘭philips 公司）；MOTIC 顯微圖像攝影系統 （德國 麥克奧迪實業集團公司）；Nova Blot 半干法轉印儀、SDS-PAGE 垂直電泳儀及ImageQuant LAS 4000 mini 凝膠成像儀（美國GE Healthcare 公司）；PCR 儀器（德國Eppendof 公司）。

1.2 方法

1.2.1 動物造模 隨機抽取20 只家兔為正常對照組，其余130 只參照文獻[5]造模。 將鹽酸阿霉素配制成濃度為1 mg/mL 的溶液，經耳緣靜脈注射藥量為1 mg/kg， 每周2 次， 連續8 周， 即累計給藥量至16 mg/kg。 造模后左心室射血分數（LVEF）、左心室短軸縮短率(LVFS)、E 峰與A 峰的比值（E/A）顯著降低（P﹤0.01）；造模后室間隔厚度（IVS）、 左心室后壁（LVPW）、左心室收縮末期內徑(LVIDs)、左心室舒張末期內徑(LVIDd) 及血清BNP 顯著升高 （P﹤0.01），且家兔出現精神差、少動、納食減少等心衰表現，說明造模成功。

1.2.2 實驗分組及處理 將造模成功兔隨機分為5組，模型組（21 只）、益心泰低（21 只）、中（21 只）、高劑量組（21 只）和氯沙坦鉀組（20 只），加上正常對照組（20 只）。 于實驗第9 周開始灌胃，正常對照組和模型組均以等容積的生理鹽水灌胃， 益心泰低、中、高劑量組分別按照2.1、4.2、8.4 g/kg（分別相當于人臨床用量5、10、20 倍）灌胃，氯沙坦組予氯沙坦2.73 mg/kg 灌胃。 共4 周，1 次/d， 灌胃容積為10 mL/kg。

1.3 觀察指標及方法

用藥4 周后，麻醉處死全部實驗兔，取兔心肌組織，切成多份，100 mg/份，待測。

1.3.1 心肌細胞內鈣離子[Ca2+]i 采用激光共聚焦顯微鏡掃描測定。 熒光探針標記： 將心肌細胞于37 ℃水浴中用Fluo3/AM 避光孵育60 min，1 750 g離心1 min，去除負載液，生理記錄液洗滌3次。 應用激光共聚焦顯微鏡掃描形態完整及染色效果好的細胞。 心肌細胞熒光值（鈣離子濃度）測定：激發波長為488 nm，發射波長為520 nm。圖像經過計算機系統處理后得到細胞內分布圖，經系統分析和換算后得出Ca2+熒光強度。

1.3.2 心肌組織鈣調神經磷酸酶(CaN)活性 采用酶學比色法測定。 酶促反應：將對照管、測定管離心10 min，3 500 r/min，取上清液50 μL 定磷，再室溫靜置5 min，636 nm，0.5 cm 光徑， 以蒸餾水調零，標準空白管、磷(P)標準管、組織勻漿樣品管及其對照管均加入50 μL 待測溶液， 測各管吸光度OD值，計算CaN 活力。

1.3.3 心肌組織T 細胞活化因子3 （NFAT3）、p-NFAT3 表達 采用Western blot 法檢測。 心肌組織冰上勻漿60 min，充分裂解后，4 ℃21 000 g 離心30 min，取上清，Bradford 法測定蛋白質，制備SDSPAGE 濃縮膠與分離膠、上樣，電泳，先16 mA/gel跑15 min，然后32 mA/gel 跑至溴芬蘭指示劑到達膠的底部時即停止， 然后0.8 mA/cm2， 轉移1、2、3 h，分別與一抗（1∶500）、二抗（1∶2 000）溫育。 顯影成像，計算其與β-actin 的比值。

1.3.4 心肌組織NFAT3 mRNA 表達 采用RTPCR 法檢測。提取總RNA：TRIzol 抽提總RNA，測定OD 值，檢測RNA 的純度及濃度并定量。 逆轉錄合成cDNA：配置逆轉錄反應體系(20 μL)，置于PCR儀中，42 ℃60 min，75 ℃10 min，4 ℃5 min。 引物設計與合成：β-actin： 上游5'-ACACTGTGCCCATCTACGAGG -3'； 下 游 5' -AGGGGCCGGACGCGTCATACT-3'。 NFAT3： 上 游 5'-ACAGAAGAGGGGGCGTCTCAG -3'； 下 游 5' -ACCAATAGGGGCAGCACCATA-3'。 PCR 反應體系：配置逆轉錄反應體系(20 μL)， 置于PCR 儀中，95℃5 min，94 ℃1 min，54 ℃1 min，72 ℃1 min，重復30 次，然后72 ℃5 min，4 ℃冰箱保存。 瓊脂糖凝膠電泳：擴增產物10 μL，電壓120 V，1.5%瓊脂糖凝膠電泳， 用Gel pro 4.0 版凝膠成像系統分析，計算NFAT3/β-actin 比值。

1.3.5 心肌組織病理結構觀察 4%多聚甲醛固定心肌組織48 h，梯度乙醇脫水，二甲苯透明4 h、石蠟包埋、 切片厚4～5 μm、60 ℃溫箱中烤片、HE 染色、光鏡觀察并采圖。

1.4 統計學分析

采用統計軟件SPSS 17.0 進行數據處理。 計量資料以“±s”表示，多樣本間均數比較采用方差分析，P﹤0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 動物死亡情況

正常組因麻醉意外死亡1 只，模型組，益心泰高、中、低組和氯沙坦鉀組因腹瀉分別死亡2、1、1、1、1 只。

2.2 心肌細胞內[Ca2+]i 含量及心肌組織CaN 水平

與正常對照組比較， 模型組心肌細胞內[Ca2+]i含量及心肌組織CaN 水平顯著升高（P﹤0.01）。 與模型組比較，益心泰低、中、高劑量組和氯沙坦鉀組心肌細胞內[Ca2+]i 含量及心肌組織CaN 水平顯著降低（P﹤0.01）。 詳見表1。

表1 各組心肌細胞內[Ca2+]i 含量及心肌組織CaN 水平的變化（±s）

表1 各組心肌細胞內[Ca2+]i 含量及心肌組織CaN 水平的變化（±s）

注：與正常對照組比較●●P＜0.01；與模型組比較★P＜0.05，★★P＜0.01。 下表同。

組 別正常對照組模型組益心泰低劑量組益心泰中劑量組益心泰高劑量組氯沙坦鉀組n 19 19 20 20 20 19[Ca2+]i(nmol/L)75.10±5.24 161.60±10.60●●141.30±8.33★★134.67±9.63★★130.97±6.89★★131.66±6.95★★CaN(U/mg 蛋白)3.49±0.29 8.55±0.45●●7.15±0.43★★6.83±0.58★★6.55±0.41★★6.57±0.55★★

2.3 心肌組織NFAT3、p-NFAT3 及NFAT3 mRNA表達

與正常對照組比較，模型組心肌組織NFAT3、p-NFAT3及NFAT3mRNA 表達顯著升高 （P﹤0.01）。與模型組比較， 益心泰低劑量組心肌組織NFAT3、NFAT3mRNA 表達降低（P﹤0.05），p-NFAT3表達顯著降低（P﹤0.01），而益心泰中、高劑量組和氯沙坦鉀組心肌組織NFAT3、p-NFAT3及NFAT3mRNA 表達顯著降低（P﹤0.01）。 詳見表2。

表2 各組心肌組織NFAT3、p-NFAT3 及NFAT3 mRNA 表達（±s）

表2 各組心肌組織NFAT3、p-NFAT3 及NFAT3 mRNA 表達（±s）

組 別正常對照組模型組益心泰低劑量組益心泰中劑量組益心泰高劑量組氯沙坦鉀組n 19 19 20 20 20 19 NFAT3 0.26±0.02 0.86±0.06●●0.79±0.06★0.73±0.06★★0.69±0.05★★0.71±0.05★★p-NFAT3 0.17±0.03 0.64±0.04●●0.50±0.04★★0.47±0.05★★0.45±0.05★★0.45±0.06★★NFAT3 mRNA 0.17±0.04 0.79±0.06●●0.73±0.09★0.58±0.09★★0.55±0.08★★0.54±0.08★★

2.4 心肌組織病理結構

正常對照組心肌細胞排列正常， 無斷裂和水腫，細胞間質無炎細胞浸潤。 模型組心肌細胞排列紊亂，部分斷裂；心肌細胞明顯水腫、壞死，大量炎細胞浸潤。 益心泰低劑量組心肌細胞排列紊亂，心肌細胞輕度水腫，有較多炎細胞侵潤。 益心泰中劑量組心肌纖維排列基本正常， 有較多炎細胞浸潤。高劑量組心肌纖維排列基本正常， 少許炎細胞浸潤。 氯沙坦鉀組心肌纖維排列正常，間質少量炎細胞浸潤。 見第72 頁彩圖圖1。

3 討論

本研究采用阿霉素耳緣靜脈注射致CHF 兔模型，造模后存活104 只，均符合造模成功標準，造模成功率80%（104/130）。 其他家兔因腹瀉致死，可能為家兔不耐受阿霉素的毒副作用， 出現了腸炎，最后因脫水而發生休克致死亡。 與文獻[6]報道阿霉素致結腸炎而造成動物造模成功率低結果吻合。

心肌重構是CHF 發展的病理生理基礎，在心肌重構的發生發展過程中，鈣調神經磷酸酶（CaN）往往作為起始信號傳導系統，其蛋白表達水平的改變遠遠早于心肌重構的發生[7]。 而作為鈣調神經磷酸酶的下游轉錄因子活化T 細胞核因子（NFATc）包括5 種成員， 其中NFAT3作為CaN 的下游蛋白，在CaN 介導的心肌重構中發揮著重要作用[8]。 Ca2+作為細胞內信號傳導的信使， 與CaN 介導的信號通路密切相關。 心肌細胞漿內的Ca2+升高，激活CaN，使磷酸化的NFAT3去磷酸化并進入細胞核，誘導多種與心肌細胞增殖相關的基因表達，最終導致心肌重構，發展為心衰。

益心泰顆粒為作者經驗方，方中君藥黃芪既可補氣，又可利水消腫；臣藥丹參活血化瘀；佐藥澤瀉、豬苓為利水滲濕；使藥紅花，載藥入心經。 本研究結果顯示，與正常對照組比較，模型組心肌細胞內[Ca2+]i 含量、心肌組織CaN 水平、NFAT3、p-NFAT3及NFAT3mRNA 表達顯著升高，且病理結構中也顯示心肌細胞排列明顯紊亂，細胞明顯水腫、壞死，出現大量炎細胞浸潤。 說明CHF 兔Ca2+-CaN-NFAT3信號通路被激活，誘導大量炎性細胞的浸潤，從而導致心肌細胞水腫、壞死，排列紊亂。 與模型組比較，益心泰低劑量組心肌組織NFAT3、NFAT3mRNA 表達降低，心肌細胞內[Ca2+]i 含量及心肌組織CaN 水平、p-NFAT3顯著降低，而益心泰中、高劑量組和氯沙坦鉀組心肌細胞內[Ca2+]i 含量、 心肌組織CaN 水平、NFAT3、p-NFAT3及NFAT3mRNA 表達顯著降低，說明益心泰能有效阻斷心肌組織內該信號傳導通路的激活，減少炎性細胞的浸潤，減輕心肌細胞的水腫等，從而有效治療CHF。 綜上可知， 益心泰顆粒抑制慢性心力衰竭時Ca2+-CaN-NFAT3信號通路激活，可能是其治療慢性心衰的主要機制之一。

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