“肝病實脾”法對ACLF大鼠內(nèi)毒素血癥的影響

何 琬，陳 斌*，徐嘉蔚，王國棟，劉 璇

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙410007；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，湖南 長沙410208）

研究發(fā)現(xiàn)[1]，肝衰竭大鼠存在胃腸蠕動功能障礙，促進了腸源性內(nèi)毒素血癥的發(fā)生，由此引起多種細(xì)胞因子的分泌與釋放，造成肝臟的二次損傷， 加重病情的進展。 肝衰竭患者常伴有不同程度的腹脹、食欲不振、惡心、便秘或腹瀉等胃腸運動功能異常， 屬中醫(yī)脾虛證范疇。 我院在肝衰竭傳統(tǒng)治療方法解毒化瘀基礎(chǔ)上加用健脾益氣或健脾溫陽藥物[2-3]，臨床療效顯著，但其機制不明確。 本研究擬從胃腸動力學(xué)變化及門脈內(nèi)毒素水平，探討“肝病實脾”之解毒化瘀、益氣健脾法治療慢加急性肝衰竭（acute-on-chronic liver failure，ACLF）的可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康Wistar 大鼠70 只，雌雄各半，體質(zhì)量120～140 g，由中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供，許可證號：SCXK-(軍)2012-0004。 動物飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心， 飼養(yǎng)溫度24～26 ℃，相對濕度55%～65%，喂普通飼料，飲冷開水。

1.2 藥物與試劑

解毒化瘀方由茵陳30 g、 虎杖30 g、 大黃10 g、丹參30 g、赤芍50 g 組成，健脾方組由黃芪30 g、白術(shù)20 g 組成，藥物均采用單味中藥配方顆粒（廣東一方制藥有限公司），谷丙轉(zhuǎn)氨酶測定試劑盒（長春匯力生物技術(shù)有限公司）；谷草轉(zhuǎn)氨酶測定試劑盒（長春匯力生物技術(shù)有限公司）；顯色基質(zhì)鱟試劑盒 （廈門市鱟試劑實驗廠有限公司， 批號：140325）；牛血清白蛋白（北京Solarbio 公司，批號：628C053）；弗氏不完全佐劑（美國Sigma-Aldrich，批號：1001646388）；D-氨基半乳糖（美國Sigma）；羧甲基纖維素（美國Sigma）；水合氯醛（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司），大鼠胃動素（motilin，MTL）ELISA試劑盒（美國RD 公司，批號：20140919）。

1.3 主要儀器

JY92-Ⅱ型超聲波細(xì)胞粉碎機 （寧波新芝技術(shù)公司），SK3003 半自動生化分析儀（深圳市盛信康科技有限公司），722 s 可見光分光度計 （上海精密科學(xué)儀器有限公司制造）；電子天平ME2001E/02[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]。

1.4 溶液的制備

1.4.1 營養(yǎng)性半固體糊[4]取羧甲基纖維素5 g，溶于125 mL 蒸餾水中，然后依次加入奶粉8 g、白糖4 g、淀粉4 g，且每加1 次攪拌1 次，攪拌均勻后，再加入活性炭1.5 g， 攪拌均勻， 最后配制成約150 mL 含150 g 的營養(yǎng)半固體糊。 置4 ℃冰箱冷藏，用前2 h 取出，恢復(fù)至室溫。

1.4.2 牛血清白蛋白乳化液[5]牛血清白蛋白液：取牛血清白蛋白5 g，加生理鹽水5 mL，混勻配為1000 mg/mL。 取0.5 mL （500 mg） 加入生理鹽水30.75 mL，配成31.25 mL。乳化：取上述牛血清白蛋白液20 mL（320 mg）與弗氏不完全佐劑20 mL 置燒杯內(nèi)，在超聲波細(xì)胞粉碎機上乳化，至液滴入水不散開，成乳化液（含牛血清白蛋白8 mg/mL）。

1.5 動物造模與給藥

參照文獻方法[5-7]，并加以改進。 70 只Wistar 大鼠，雌雄各半，分為4 組：正常組10 只，其余60 只隨機分成3 組制作免疫性肝纖維化模型。 （1）牛血清白蛋白致敏：除正常組外，每次取0.5 mL 乳化液大鼠皮下多點注射， 第1-2 次間隔14 d， 第2-3 次、3-4次間隔10 d。 （2）牛血清白蛋白攻擊：每周2 次尾靜脈注射牛血清白蛋白，劑量每次0.4 mL/只，牛血清白蛋白含量自2 mg/次漸加0.5 mg/次至4 mg/次，維持此劑量，共6 周（12 次），成模35 只，分別是模型組10 只，對照組12 只，實驗組13 只。 （3）急性攻擊：6周末， 除正常組外， 均予以D-氨基半乳糖1.2 g/kg一次性腹腔注射，建立慢加急性肝衰竭模型。

采取灌胃給藥方法，按照人與大鼠體表面積的換算關(guān)系，計算出大鼠健脾方的日用量4.5 g/kg，實驗組（解毒化瘀+健脾）的日用量18 g/kg、對照組(解毒化瘀)的日用量13.5 g/kg。實驗組在尾靜脈牛血清白蛋白攻擊的同時開始健脾藥物灌胃給藥，至處死前7 d 加用解毒化瘀顆粒，用藥時間為6 周；對照組于動物處死前7 d 開始灌胃解毒化瘀顆粒；正常組與模型組大鼠給予等劑量生理鹽水， 于處死前7 d 開始灌胃給藥； 以上各組均每天灌胃1 次，3 mL/次。

1.7 觀察指標(biāo)

1.7.1 內(nèi)毒素檢測 抽取門靜脈血1 mL 裝入無熱原抗凝管，3 000 r/min，離心2 min，取上清血漿標(biāo)本，參照顯色基質(zhì)鱟試劑盒說明書，行內(nèi)毒素檢測。

1.7.2 血清MTL 濃度檢測 抽取右心房血2 mL，注入促凝管中，3 000 r/min，離心4 min，取血清，行酶聯(lián)免疫吸附檢測。

1.7.3 胃排空率、小腸推進率的測定[4，8]大鼠末次給藥后禁食不禁水16 h， 予營養(yǎng)性半固體糊灌胃2 mL/只，30 min 后， 用4%水合氯醛以 0.3 mL/100 g 腹腔注射麻醉。 迅速打開腹腔，分離腸胃。 結(jié)扎胃賁門和幽門，取胃，用濾紙吸干后稱全質(zhì)量，然后沿胃大彎剪開胃體， 用蒸餾水洗去胃內(nèi)容物后，拭干，稱凈質(zhì)量。 以胃全質(zhì)量和胃凈質(zhì)量之差為胃內(nèi)殘留物質(zhì)量，計算胃內(nèi)殘留物占所灌半固體米糊的質(zhì)量百分比為胃內(nèi)殘留率。 同時迅速取出小腸，輕輕剝離后直鋪于試驗臺白紙上，不牽拉，用直尺測量幽門至回盲腸部全長及幽門至黑色半固體糊前沿的距離，并計算小腸推進率。

1.8 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)處理采用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，各組實驗數(shù)據(jù)以“±s”表示。 多組間計數(shù)資料比較采用方差分析， 兩組間比較采用LSD 檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.01 為差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠門靜脈內(nèi)毒素水平的比較

與正常組相比，模型組大鼠門靜脈內(nèi)毒素水平顯著升高，有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.01)；實驗組大鼠門靜脈內(nèi)毒素水平與模型組、對照組比較，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。 見表1。

2.2 各組大鼠血漿胃動素水平的比較

模型組MTL 降低，與正常組相比有顯著性差異(P＜0.01)。實驗組大鼠MTL 水平與模型組、對照組比較，差異均有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。 見表1。

表1 各組大鼠內(nèi)毒素、胃動素水平比較 （±s）

表1 各組大鼠內(nèi)毒素、胃動素水平比較 （±s）

注：與正常組比較△△P＜0.01；與模型組比較**P＜0.01；與對照組比較##P＜0.01。 下表同。

組 別正常組模型組對照組實驗組n 10 10 12 13內(nèi)毒素(EU/mL)0.572±0.189 5.774±1.636△△5.463±0.688 3.972±0.834**##胃動素(ng/L)140.15±11.02 45.42±3.70△△47.23±5.05 61.85±6.5**##

2.3 各組大鼠胃內(nèi)殘留率和小腸推進率的比較

與正常組相比，模型組大鼠的胃內(nèi)殘留率顯著升高，小腸推進率顯著下降(P＜0.01)；說明造模后各組大鼠胃排空時間延長，小腸推進功能緩慢；實驗組與模型組、對照組比較，大鼠胃內(nèi)殘留率下降，小腸推進率顯著升高(P＜0.01)。 見表2。

表2 各組大鼠胃殘留率、小腸推進率比較 （±s）

表2 各組大鼠胃殘留率、小腸推進率比較 （±s）

組 別正常組模型組對照組實驗組n 10 10 12 13胃殘留率(%)57.85±15.08 78.15±11.92△△73.33±13.36 62.12±13.30**##小腸推進率(%)57.38±5.72 32.39±8.4△△36.56±8.68 52.45±12.52**##

3 討論

生理上肝依五行關(guān)系而克脾土，病理上肝郁可橫逆犯脾，土虛也可導(dǎo)致木侮，脾臟易虛，脾虛失運，土壅木郁，肝氣失于條達，血行不暢，同時易致濕、熱、疫毒等外邪內(nèi)侵，留滯不去，導(dǎo)致了疾病的發(fā)生，正如李東垣在《脾胃論·脾胃盛衰論》中說“百病皆由脾胃衰而生也。 ”陳復(fù)正《幼幼集成》中曰：“益脾土強者，足以捍御濕熱，必不生黃，惟其脾虛不運，所以濕熱乘之。 ”因此，在治療肝病的時候，就應(yīng)當(dāng)先實其脾氣，以免肝邪犯脾，導(dǎo)致疾病進一步發(fā)展。 所謂 “正氣存內(nèi)，邪不可干”，從胃腸著眼，“正氣存內(nèi)”則主要體現(xiàn)在胃氣健旺、小腸分清別濁和大腸通降正常，亦即現(xiàn)代醫(yī)學(xué)所說的胃腸正常結(jié)構(gòu)與功能[9]。 因此治療肝衰竭時在傳統(tǒng)治療方法解毒化瘀基礎(chǔ)上加用健脾益氣或健脾溫陽藥物，可使臨床療效顯著提高。

肝衰竭時，由于腸道菌群紊亂，細(xì)菌異常增殖，內(nèi)毒素產(chǎn)生增多，肝臟發(fā)生大面積壞死，Kuffer 細(xì)胞功能嚴(yán)重受損， 對內(nèi)毒素的清除和解毒能力減弱，易致內(nèi)毒素血癥，激活細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，釋放大量的炎性介質(zhì)(如TNF-α 等)和氧自由基，導(dǎo)致胃腸黏膜的缺血、缺氧和血管通透性增加，造成血液循環(huán)障礙、腸黏膜水腫，蠕動減慢、消化吸收功能障礙，加重腸源性內(nèi)毒素血癥的產(chǎn)生，反過來又加重肝衰竭的進展。 本研究結(jié)果也證實了ACLF 大鼠存在胃腸功能障礙，胃動素水平下降和腸源性內(nèi)毒素血癥（intestinal endotoxemia，IETM）。

本實驗結(jié)果證實，解毒化瘀法經(jīng)早期加用健脾藥物黃芪、白術(shù)干預(yù)后，能使ACLF 大鼠胃動素含量增多，胃內(nèi)殘留率顯著下降、小腸推進率顯著升高，結(jié)果表明“肝病實脾”能促使胃排空和小腸推進，增加腸道的推進式蠕動可以防止腸腔內(nèi)容物的瘀滯和細(xì)菌的過度生長，減少致病菌及內(nèi)毒素對腸黏膜屏障的損傷，加快腸道內(nèi)毒素的排出，從而改善IETM，及減輕內(nèi)毒素對肝臟的損傷。本實驗結(jié)果證實了“肝病傳脾”，致脾運化功能失常(胃排空、小腸推進率降低)，濕毒內(nèi)蘊(包括血中內(nèi)毒素增加)，損及于肝。 因此，選擇用中藥來維持和恢復(fù)胃腸正常結(jié)構(gòu)與功能可以從健脾益氣、“肝病實脾”的角度著手治療。 本研究結(jié)果將為“肝病實脾”早期干預(yù)ACLF 提供理論與實驗依據(jù)， 也為中醫(yī)治療ACLF 提供一種全新的研究思路。

[1]潘巧玲，劉小靜，葉 峰，等. TAA 致大鼠急性肝衰竭的胃腸功能及病理改變[J].西安交通大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版)，2008，29(1)：66-69.

[2]伍玉南，孫克偉，彭建平，等.解毒化瘀溫陽健脾與解毒化瘀益氣健脾法治療慢性重型肝炎的臨床觀察[J]. 中西醫(yī)結(jié)合肝病雜志，2011，21(1)：4－7.

[3]孫克偉，陳 斌，黃裕紅，等.涼血解毒、清熱化濕和涼血解毒、健脾溫陽法治療慢性重型肝炎的臨床觀察[J]. 中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2006，26(11)：981－983.

[4]劉未艾，何亞敏.隔藥餅灸對肝郁脾虛型功能性胃腸病大鼠胃排空、小腸推進功能影響等效性隨機平行對照研究[J].實用中醫(yī)內(nèi)科雜志，2013，27(1)：79-82.

[5]曹承樓. Ax1 調(diào)控樹突狀細(xì)胞凋亡在茵陳蒿湯治療慢加急性肝衰竭大鼠中的作用[D].長沙：湖南中醫(yī)藥大學(xué)，2014.

[6]劉旭華.大鼠慢加急性肝衰竭實驗?zāi)Ｐ偷慕⒓捌洳±頇C制初步研究[D].北京：首都醫(yī)科大學(xué)，2007.

[7]Wang LK，Wang LW，Li X，et al. Ethyl pyruvate prevents inflammatory factors release and decreases intestinal permeability in rats with D-galactosamine-induced acute liver failure [J].Hepatobiliary & Pancreatic Diseases International，2013，12 (2)：180-188.

[8]邢建峰，封衛(wèi)毅，侯家玉.小鼠胃排空及小腸推進實驗方法的探討[J].北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2003，26(4)：50－52.

[9]張振字，楊大國.中西醫(yī)結(jié)合治療慢性肝病并腸道菌群失調(diào)與內(nèi)毒素血癥的研究近況. 中華中醫(yī)藥學(xué)會第11 屆肝膽病學(xué)術(shù)會議論文集[C].宜昌：中華中醫(yī)藥學(xué)會，2004：191.