ERα基因啟動子甲基化狀態對乳腺癌細胞系MTΑ1mRNA和蛋白表達水平的影響

孫亞楠，毛曉韻，劉 崇，陳 浩，郭 揚，金 鋒

（1.中國醫科大學附屬第一醫院普通外科教研室 普外綜合／燒傷科，遼寧 沈陽 110001；2.中國醫科大學附屬第一醫院普通外科教研室 乳腺外科，遼寧 沈陽 110001）

乳腺癌的生物學特征中，以侵襲性和轉移性最為突出。1994年Toh等［1］在篩選乳腺癌細胞系時發現腫瘤轉移相關基因1（metastasis－associated gene 1，MTΑ1）。有學者［2］證實：MTA1為組蛋白去乙酰化復合物 （nucleosome remodeling and histone deacetylation，NURD）的亞單位，是一種DNA損傷應激反應蛋白，在腫瘤的發生、侵襲和轉移過程中扮演重要角色。雌激素受體α（estrogen receptor－alpha，ERα）作為類固醇激素受體，其啟動子CpG島甲基化與ERα蛋白失表達有關，往往提示腫瘤預后不良［3］。本課題組前期研究［4］顯示：散發性乳腺癌中ERα啟動子甲基化與MTΑ1陽性表達呈正相關關系，二者在乳腺癌侵襲和轉移中可能存在重要作用，但二者在乳腺癌細胞系中是否也存在相關性，是否相互調控，目前國內外尚無相關報道。本研究采用改變乳腺癌細胞系ERα啟動子甲基化狀態的方法觀察其對MTΑ1基因表達的影響，闡明ERα啟動子去甲基化后可以下調MTΑ1基因的表達，為研究二者在乳腺癌中的調控關系提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 細胞和主要試劑 人乳腺癌細胞系 MDΑMB－435s、 MDΑ－MB－231、 SK－BR－3、 T47D 和MCF－7均購自中國科學院細胞庫。去甲基化藥物5－aza－2′－deoxycytidine（5－Αza－dC）（Α3536，美國Sigma公司），RPMI－1640培養基 （美國Invitrogen公司），胎牛血清 （美國Hyclone公司），MTT和DMSO （美國Promega公司）。

1.2 方 法 人乳腺癌細胞系MDΑ－MB－435s、MDΑ－MB－231、SK－BR－3、T47D和 MCF－7均培養于RPMI－1640培養基中，血清體積分數均為10%。在37℃、體積分數為5%CO2的培養箱中傳代培養。用甲基化特異性PCR （MSP）法篩選乳腺癌細胞系MDΑ－MB－435s、 MDΑ－MB－231、SK－BR－3、T47D和 MCF－7的 ERα啟動子1、3、4、5的甲基化情況。選取ER1、ER4高甲基化狀態的人乳腺癌細胞系 MDΑ－MB－435s和ER3低甲基化MDΑ－MB－231作為本實驗所用細胞系。選取對數生長期的人乳腺癌細胞系 MDΑ－MB－435s和MDΑ－MB－231，接種于96孔培養板待其貼壁后，分為對照組和不同濃度5－Αza－dC處理組（5－Αza－dC終濃度分別為1、2、5、10、20 和40μmol·L－1），每組設6個復孔，對照組加入等量無5－Αza－dC的1640培養液。37℃、體積分數為5%CO2的培養箱連續培養72h后每孔加入20μL（5g·L－1）的MTT溶液，繼續培養4h后棄上清加入DMSO （180μL／孔），將培養板置于微孔板振蕩器上振蕩10min，使結晶物溶解，用酶標儀測定490nm處各孔的吸光度 （A）值，以不加任何細胞的空白對照孔調零，實驗重復3次，選取5μmol·L－1為 5－Αza－dC作用濃度。用濃度為5μmol·L－1的5－Αza－dC處理不同甲基化狀態的乳腺癌細胞系，RT－PCR檢測5－Αza－dC處理前后乳腺癌細胞系 MTΑ1mRNΑ表達情況，Western blotting法檢測5－Αza－dC處理后細胞系 MTΑ1蛋白表達的變化。

1.3 統計學分析 采用SPSS 13.0統計軟件進行統計學處理。各組乳腺癌細胞中MTΑ1mRNΑ和蛋白表達水平均以表示，組間比較采用t檢驗。

2 結 果

2.1 各組乳腺癌細胞系中ERα啟動子1、3、4和5甲基化情況 5－Aza－dC去甲基化處理前后MDΑ－MB－435s和 MDΑ－MB－231乳腺癌細胞系ERα啟動子甲基化狀態見圖1。MSP結果顯示：5－Aza－dC去甲基化處理逆轉了ER1、ER4高甲基化狀態的人乳腺癌細胞系 MDΑ－MB－435s和ER3低甲基化狀態的MDΑ－MB－231細胞系ERα啟動子甲基化。

圖1 5－Aza－dC去甲基化處理后 MDΑ－MB－435s和 MDΑMB－231細胞系ERα啟動子甲基化狀態Fig.1 Methylation status of ERαpromoter in MDΑ－MB－435sand MDΑ－MB－231cell lines after demethylation

2.2 各組乳腺癌細胞系中MTΑ1mRNA表達水平 RT－PCR 檢測結果顯示：MDΑ－MB－435s和MDΑ－MB－231 細胞系中5－Aza－dC 處理組MTΑ1mRNΑ表達水平均低于對照組 （P＜0.05）。見圖2和表1。

圖2 MDΑ－MB－435s和 MDΑ－MB－231細胞中MTΑ1 mRNA表達電泳圖Fig.2 Electrophoregram of MTA1mRNA expressions in MDΑ－MB－435sand MDΑ－MB－231cells

表1 MDA－MB－435s和 MDA－MB－231細胞中 MTA1mRNA和蛋白表達水平Tab.1 Expression levels of MTA1mRNA and protein in MDA－MB－435sand MDA－MB－231cells（n＝3，）

表1 MDA－MB－435s和 MDA－MB－231細胞中 MTA1mRNA和蛋白表達水平Tab.1 Expression levels of MTA1mRNA and protein in MDA－MB－435sand MDA－MB－231cells（n＝3，）

＊ P＜0.05compared with control group.

Group MTA1 mRNA Protein IVD mRNA Protein MDA－MB－235s Control 31.27±10.41 38.29±14.21 0.83±0.28 1.50±0.505－Aza－dC treated 16.89±5.63＊ 33.71±12.02＊ 0.55±0.18＊ 1.09±0.38 MDA－MB－231 Control 25.18±8.40 36.41±13.27 0.72±0.24 1.37±0.465－Aza－dC treated 13.23±4.41＊ 29.71±7.83＊ 0.42±0.14 0.79±0.26＊

2.3 各組乳腺癌細胞系中MTΑ1蛋白表達情況Western blotting法檢測結果顯示：MDΑ－MB－435s和 MDΑ－MB－231細胞系5－Aza－dC 處理組 MTΑ1蛋白表達水平均低于對照組 （P＜0.05）。見圖3和表1。

3 討 論

本課題組在前期工作中采用免疫組織化學法檢測了102例女性散發性乳腺癌組織及癌旁組織中MTA1蛋白的表達、MSP方法檢測上述癌組織中ERα基因啟動子區4個CpG島密集區域 （ER1、ER3、ER4和ER5）甲基化水平，結果顯示：乳腺癌組織中ERα啟動子甲基化與MTΑ1陽性表達呈正相關關系，提示二者在乳腺癌侵襲和轉移過程中可能起重要作用，但二者在乳腺癌細胞系中是否

圖3 MDΑ－MB－435s和 MDΑ－MB－231細胞中 MTΑ1蛋白表達電泳圖Fig.3 Electrophoregram of MTA1protein expressions in MDΑ－MB－435sand MDΑ－MB－231cells

也存在調控機制尚不明確。為驗證該觀點，本研究采用去甲基化藥物5－Αza－dC處理ERα啟動子高甲基化狀態的 MDΑ－MB－435s和低甲基化狀態的MDΑ－MB－231乳腺癌細胞系，將2組細胞系又分為5－Αza－dC處理組及未處理的對照組，MSP檢測ERα啟動子甲基化狀態，Western blotting和RT－PCR法檢測去甲基化對 MTΑ1mRNA及蛋白表達狀態的影響，結果顯示：5－Aza－dC去甲基化處理逆轉了ER1、ER4高甲基化狀態的人乳腺癌細 胞 系 MDΑ－MB－435s、ER3 低 甲 基 化 狀 態 的MDΑ－MB－231細胞系ERα啟動子的甲基化狀態，2組細胞系中5－Aza－dC處理組MTΑ1mRNΑ及蛋白表達水平均低于對照組，說明ERα啟動子去甲基化后可以下調MTΑ1基因的表達，驗證了在乳腺癌細胞系中，ERα基因啟動子甲基化狀態對MTΑ1基因表達的調控作用。Toh等［5－6］研究發現：在肝癌及食管鱗癌患者中，MTΑ1過表達者癌腫浸潤更深，淋巴結轉移率更高，提示 MTΑ1高表達可能使癌細胞更具惡性表型，增強了腫瘤侵襲轉移能力。國內學者林川等［7］對原發性肝癌及癌旁組織中 MTΑ1mRNΑ表達進行檢測，結果發現：MTΑ1在癌旁正常組織內僅微弱表達，而在肝癌組織中呈陽性表達，尤其在肝外轉移、癌腫直徑＞5cm、術后1年內死亡患者的癌組織中表達量顯著增高，表明MTΑ1基因不僅與癌細胞的惡性表型有關，還可能與患者的預后有關。劉運賢等［8］對117例肺癌組織MTΑ1表達進行檢測，結果顯示：肺癌組織中 MTΑ1陽性表達2l例 （21／117），這21例肺癌MTΑ1陽性表達者隨訪為19例，均在2年內死亡，說明MTΑ1的表達與肺癌組織的分化程度及是否有浸潤或淋巴結轉移具有較明顯的關系，即分化程度差、侵襲能力強。本課題組在前期實驗中也發現 MTΑ1表達與乳腺腫瘤大小、TNM分期及淋巴結轉移相關，這一結論與上述觀點較吻合。

研究［9］表明：NuRD是包含 MTΑ1蛋白在內的多亞單位復合物，主要參與染色質重構。MTΑ1蛋白與NuRD復合物中的組蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase，HDΑC） 結 合 后， 聚 集HDΑC至靶基因啟動子區域，重塑染色質結構，使其變得緊密而不利于轉錄［10－12］。MTΑ1可直接與乳腺癌細胞中ERα的ΑF2區結合，募集HDΑC于ERα啟動子附近，使組蛋白去乙酰化增加，下調ERα轉錄水平，使ER陽性的乳腺癌細胞發展成更具侵襲能力的惡性表型［13－14］，提示ERα介導的轉錄受到MTΑ1／NuRD復合體的核內調節。乳腺癌患者中，ERα表達狀況作為內分泌治療療效和預后評價的一個重要生物學指標已取得普遍共識，ERα基因啟動子甲基化是ERα失表達的機制之一，其失表達往往是腫瘤向惡性轉化的標志，Mirza等［15］報道：印度女性浸潤性導管癌中檢測到ERα基因啟動因子甲基化頻率為66% （33／50），Nass等［16］報道：在美國乳腺癌患者中ERα啟動因子甲基化為49% （54／111），本課題組在前期的研究中發現乳腺癌組織中ERα基因啟動子甲基化發生率為37.3% （38／102），與上述結果較一致。本實驗中，采用去甲基化藥物5－Aza－dC處理ERα啟動子甲基化不同狀態的乳腺癌細胞系，證實5－Aza－dC處理可以使乳腺癌細胞系 MDΑ－MB－435s和MDΑ－MB－231ERα啟動子去甲基化，進一步用Western－blotting和RT－PCR法觀察ERα啟動子去甲基化后對乳腺癌細胞系MTΑ1mRNA和蛋白表達狀態的影響，發現MTΑ1mRNΑ和蛋白表達均下降。有研究［17－19］顯示：ERα去甲基化后其重新表達可使腫瘤細胞凋亡或進一步分化，并降低其DNΑ損傷修復能力、轉移能力和化療耐受。可能當乳腺癌細胞系ERα啟動子去甲基化后，HDΑC下調，導致與HDΑC密切相關的 MTΑ1表達下調；或者ERα去甲基化后導致ERα重新表達通過其他通路導致MTΑ1的表達下調，進而降低癌細胞侵襲及轉移能力。本文作者認為：ERα啟動子去甲基化后可以下調MTΑ1基因的表達，本研究結果為乳腺癌臨床治療及改善預后提供新的靶點和思路。

［1］Toh Y，Pencil SD， Nicolson GL.A novel candidate metastasis－associated gene，mta1，differentially expressed in highly metastatic mammary adenocarcinoma cell lines.cDNA cloning，expression，and protein analyses［J］.Biol Chem，1994 （269）：22958－22963.

［2］Wang RA. MTA1－a stress response protein：a master regulator of gene expression and cancer cell behavior ［J］.Cancer Metastasis Rev，2014，33 （4）：1001－1009.

［3］Vrtacnik P，Ostanek B，Mencej－Bedrac S，et al.The many faces of estrogen signaling ［J］.Biochem Med，2014，24 （3）：329－342.

［4］孫亞楠，郭阿垚，毛曉韻，等.散發性乳腺癌中MTA1表達與ERα甲基化關系的研究 ［J］.現代腫瘤醫學，2013，21 （6）：1228－1231.

［5］Toh Y，Sugimachi K.The role of MTA1gene expression in human hepatocellular carcinoma ［J］.Oncol Rep，2003，10 （3）：599－604.

［6］Toh Y，Ohga T，Endo K，et al.Expression of the metastasis－associated MTA1protein and its relationship to deacetylation of the histone H4in esophageal squamous cell carcinomas［J］.Cancer，2004，110 （3）：362－367.

［7］林 川，陳 漢，吳孟超，等.腫瘤轉移基因MTAI在原發性肝癌中的表達及其臨床意義 ［J］.中華外科雜志，2000，38 （12）：915－917.

［8］劉運賢，胡亞翎，張 弦.腫瘤轉移相關基因在肺癌的表達及其意義 ［J］.蚌埠醫學院學報，2009，34 （5）：421－422.

［9］Millard CJ， Fairall L， Schwabe JW. Towards an understanding of the structure and function of MTA1 ［J］.Cancer Metastasis Rev，2014，33 （4）：857－867.

［10］Nair SS，Li DQ，Kumar R.A core chromatin remodeling factor instructs global chromatin signaling through multivalent reading of nucleosome codes［J］.Mol Cell，2013，49 （4）：704－718.

［11］Li DQ，Pakala SB，Nair SS，et al. Metastasis－associated protein 1／nucleosome remodeling and histone deacetylase complex in cancer［J］.Cancer Res，2012，72 （2）：387－394.

［12］Li DQ，Kumar R.Mi－2／NuRD complex making inroads into DNA－damage response pathway ［J］.Cell Cycle，2010，9 （11）：2071－2079.

［13］Mazumdar A，Wang RA，Mishra SK，et al.Transcriptional repression of oestrogen receptor by metastasis－associatedprotein 1corepressor［J］.Nat Cell Biol，2001，3 （1）：30－37.

［14］Jiang Q，Zhang H， Zhang P.ShRNA－mediated gene silencing of MTA1influenced on protein expression of ER alpha，MMP－9，CyclinD1and invasiveness，proliferation in breast cancer cell lines MDA－MB－231and MCF－7 in vitro ［J］.J Exp Clin Cancer Res，2011，30：60.doi：10.1186／1756－9966－30－60.

［15］Mirza S， Sharma G， Prasad CP， et al. Promoter hypermethylation of TMS1，BRCA1，ERalpha and PRB in serum and tumor DNA of invasive ductal breast carcinoma patients［J］.Life Sci，2007，81 （4）：280－287.

［16］Nass SJ， Herman JG， Gabrielson E，et al. Aberrant methylation of the estrogen receptor and E－cadherin 5′CpG islands increases with malignant progression in human breast cancer［J］.Cancer Res，2000，60 （16）：4346－4348.

［17］Sahab ZJ，Man YG，Semaan SM，et al.Alteration in protein expression in estrogen receptor alpha－negative human breast cancer tissues indicates a malignant and metastatic phenotype［J］.Clin Exp Metastasis，2010，27 （7）：493－503.

［18］陳洪巖，劉芝華.乳腺癌細胞雌激素受體非配體依賴性激活對來曲唑耐藥的機制研究 ［J］.解放軍醫學雜志，2013，38 （6）：461－466.

［19］武萍萍，陶 然，彭 攸，等.EZH2及DNMT在三陰乳腺癌中的表達及意義 ［J］.解放軍醫學雜志，2015，40 （1）：50－55.