銀杏葉提取物各組分對高糖培養下系膜細胞增殖及細胞外基質積聚的抑制作用

蘇 青，孫成博，孫 波，姚云鵬，郭夢環，于曉艷

（1.吉林大學第四醫院病理科，吉林 長春 130011；2.吉林大學藥學院實驗藥理與毒理學教研室，吉林 長春 130021）

銀杏葉提取物 （ginkgo biloba leaf extract，GBE）主要包含黃酮類和內酯類。黃酮類化合物主要是由槲皮素、山奈酚和異鼠李素等黃酮苷元及其與葡萄糖等單糖以氧糖苷鍵聯接而成的糖苷組成。內酯類主要包括銀杏內酯A、B、C。本文作者前期的動物實驗研究［1］證實：GBE可明顯緩解糖尿病大鼠腎功能和形態學改變，Lei等［2］及本研究預實驗均顯示：GBE可改善高糖誘導的系膜細胞細胞外基質 （extracellular matrix，ECM）積聚。但關于GBE的有效成分通過何種機制起作用，目前國內外尚無相關報道。本研究分別從腎小球系膜細胞增殖及ECM積聚的角度，觀察GBE不同組分的作用，為闡明GBE緩解糖尿病腎病 （diabetic nephropathy，DN）的藥理作用機制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 細胞、主要試劑和儀器 正常大鼠腎小球系膜細胞系HBZY－1（上海博慧斯生物科技有限公司）。GBE（2005版銀杏葉提取物，江蘇徐州華康生物制品有限公司）；GBE注射液 （金納多，德國威瑪舒培博士藥廠）；黃酮苷元槲皮素，山奈酚，異鼠李素和內脂單體銀杏內脂A、銀杏內脂B、銀杏內脂C（純度≥98%，上海同田生物技術有限公司）；DMEM （低糖）培養基 （美國Gibco公司）；胎牛血清 （天津灝洋生物技術有限公司）；胰酶（北京鼎國生物技術有限公司）；兔抗大鼠纖維連接蛋白 （FN）和Ⅳ型膠原 （ColⅣ）多克隆抗體（武漢博士德生物工程有限公司）；其他試劑均為國產和進口分析純。CO2培養箱 （日本三洋公司），DG5031型酶聯免疫檢測儀 （南京華東電子有限公司），電泳轉印裝置 （美國Bio－rad公司）。

1.2 銀杏總內酯、無內酯銀杏總黃酮的分離及銀杏總黃酮水解物的制備［3］采用GBE為原料分別制得含量為9.5%的銀杏總內酯、含量為75%的銀杏總黃酮 （無內酯）。再以銀杏葉總黃酮 （無內酯）為原料，制備含量為95%的銀杏總黃酮水解物。

1.3 腎小球系膜細胞的培養與傳代 大鼠腎小球系膜細胞HBZY－1培養于含10%小牛血清的低糖（5.5mmol·L－1）DMEM 培養液中，37℃、5%CO2飽和濕度，待細胞生長至90%以上時傳代。

1.4 MTT法檢測HBZY－1細胞增殖情況 選取狀態良好的HBZY－1細胞，以2×104／孔的密度種于96孔板，10%胎牛血清的低糖DMEM培養，24h后換用含各種銀杏葉提取物成分 （GBE、總黃酮、總內酯、總黃酮水解物、槲皮素、山奈酚、異鼠李素、銀杏內脂A、銀杏內脂B和銀杏內脂C），各成分質量濃度均分別為0、3.125、6.250、12.500、25.000和50.000mg·L－1的10%胎牛血清的高糖DMEM （30mmol·L－1）培養液，以10%低糖DMEM （5.5mmol·L－1）作為低糖對照組，37℃、5%CO2和飽和濕度條件下培養72 h。鏡下觀察細胞形態后吸棄條件培養液換成10%低糖培養液并且每孔加20μL的MTT溶液 （5g·L－1），37℃繼續孵育4h后，小心吸棄孔內上清，每孔加入150μL DMSO，震蕩10min，酶標儀490nm測定各孔吸光度 （A）值，每組3個復孔，實驗重復3次。以A值表示細胞增殖活性。

1.5 ELISA法檢測 HBZY－1細胞上清中FN和ColⅣ水平 根據MTT結果篩選對系膜細胞增殖無明顯作用的組分，采用ELISA法檢測其對高糖作用下的系膜細胞ECM主要成分FN和ColⅣ水平的影響。細胞種于24孔板中，待80%融合后，無血清培養液同步24h后分別換成含GBE、總黃酮、總內酯、銀杏內脂A、銀杏內脂B和銀杏內脂C 0、0.050、0.500、5.000、50.000mg·L－1的無血清高糖DMEM（30mmol·L－1），每組4個復孔，低糖無血清DMEM作為低糖對照組，作用48h后收集的細胞上清液，采用ELISA法檢測FN和ColⅣ水平。

1.6 統計學分析 采用SPSS 17.0統計軟件進行統計學處理。細胞增殖活性、FN和ColⅣ水平均以表示，多組間樣本均數比較采用單因素方差分析。檢驗水準α＝0.05。

2 結 果

2.1 各組細胞形態學 GBE：各濃度組細胞狀態均良好，50.000mg·L－1組細胞數目有所減少；銀杏葉總黃酮：低濃度組細胞狀態均良好，50.000mg·L－1組可見部分細胞破裂溶解；銀杏葉總內脂：各濃度組細胞狀態均良好；總黃酮水解物：6.250和12.500mg·L－1組細胞皺縮，變圓，25.000和50.000mg·L－1組大部分細胞破裂、溶解，細胞變化具有濃度依賴性；槲皮素：6.250mg·L－1組細胞皺縮、變圓，12.500mg·L－1組 約 30% 細 胞 破 裂 溶 解，25.000 和50.000mg·L－1組大部分細胞溶解消失，細胞變化具有濃度依賴性；山奈酚：12.500mg·L－1組細胞皺縮，變圓，25.000和50.000mg·L－1組大部分細胞破裂、溶解，細胞變化具有濃度依賴性；異鼠李素：12.500和25.000mg·L－1組細胞皺縮、變圓，50.000mg·L－1組大部分細胞溶解消失，細胞變化具有濃度依賴性；銀杏內脂A、銀杏內脂B和銀杏內脂C各濃度組細胞狀態均良好。

2.2 MTT法檢測各組細胞增殖情況 與高糖對照組比較，GBE僅最高濃度組（50.000mg·L－1）細胞增殖活性明顯降低 （P＜0.01），其他濃度組細胞增殖活性差異無統計學意義 （P＞0.05）；總內脂各濃度組細胞增殖活性差異均無統計學意義（P＞0.05）；25.000和50.000mg·L－1總黃酮組細胞增殖活性明顯降低 （P＜0.05或P＜0.01），其他低劑量組差異均無統計學意義 （P＞0.05）；總黃酮水解物各濃度組細胞增殖活性均明顯降低（P＜0.01）；槲皮素、山奈酚和異鼠李素各濃度組細胞增殖活性均明顯降低 （P＜0.01）；3種內脂成分除內脂C 50.000mg·L－1組細胞增殖活性明顯降低 （P＜0.05），其他各濃度組細胞活性與高糖對照組比較差異均無統計學意義 （P＞0.05）。見表1。

2.3 ELISA法檢測各組細胞FN和ColⅣ水平與高糖對照組比較，5.00和50.00mg·L－1GBE組ColⅣ和FN水平均明顯降低 （P＜0.01），0.50mg·L－1GBE組 FN 水平明顯降低 （P＜0.05）；0.50、5.00和50.00mg·L－1總黃酮組ColⅣ 水平降低 （P＜0.05或 P＜0.01）；僅50.00mg·L－1總內脂組ColⅣ和FN水平降低（P＜0.05或P＜0.01），其他濃度組無明顯變化（P ＞ 0.05）；與高糖對照組比較，僅50.00mg·L－1內脂 C 組 FN 水平降低 （P＜0.05），而內脂C其他低濃度組及內脂A、B各濃度組與高糖對照組比較差異均無統計學意義 （P＞0.05）。見表2。

3 討 論

DN是糖尿病最重要的并發癥之一，尚無十分確切有效的方法能夠防止其發生和惡化。由于GBE具有擴血管、抗凝血、降血脂、抗炎和清除自由基等作用，已被廣泛應用于心、腦血管疾病的預防和治療。近年來，有學者［1－2，4］在 DN 的實驗研究中證明：GBE通過多種機制對腎臟功能有明顯保護作用。此外多項臨床研究［5－8］表明：GBE對早期DN患者有明顯改善作用。劉曉等［9］研究發現：GBE對糖尿病大鼠的腎臟保護作用強于卡托普利和纈沙坦。

本研究首先從高糖培養下系膜細胞增殖角度觀察了GBE不同組分的細胞增殖活性。根據本研究中MTT結果，除苷元成分槲皮素、山奈酚、異鼠李素和總黃酮水解物外，其他各種組分包括總銀杏葉提取物、總黃酮、總內脂和內脂A、B、C均無較強的細胞抑制作用；針對這些組分，本研究又從ECM積聚角度檢測了其對高糖作用下的系膜細胞ColⅣ和FN水平的影響。為避免漏檢藥物在低濃度的作用，本實驗濃度設計為0、0.05、0.50、5.00和50.00mg·L－1。本研究結果顯示：GBE在高濃度狀態下 （50.00mg·L－1）抑制高糖誘導的腎小球系膜細胞增殖，而低濃度狀態下 （自0.50mg·L－1起）抑制系膜細胞ECM積聚；GBE中總黃酮在抑制細胞增殖和ECM積聚方面起主要作用，總內脂無明顯效果；總黃酮作用方式同樣是高濃度狀態下對腎臟系膜細胞增殖有抑制作用，低濃度（自0.50mg·L－1起）時抑制腎臟系膜細胞ECM水平；苷元抑制系膜細胞增殖的作用遠遠強于糖苷，苷元單體槲皮素、山奈酚、異鼠李素及總黃酮水解物明顯抑制腎臟系膜細胞增殖，并且具有濃度依賴性。

表1 各組系膜細胞增殖活性Tab.1 Proliferation activities of mesangial cells in various groups （n＝6，）

表1 各組系膜細胞增殖活性Tab.1 Proliferation activities of mesangial cells in various groups （n＝6，）

＊ P＜0.05，＊＊ P＜0.01compared with high－glucose control group.

Group A value Group A value GBE Kaempferorl Low－glucose control 0.37±0.04＊＊ Low－glucose control 0.37±0.04＊＊High－glucose control 0.47±0.06 High－glucose control 0.47±0.063.125 0.42±0.03 3.125 0.30±0.08＊＊6.125 0.48±0.04 6.125 0.10±0.03＊＊12.500 0.49±0.02 12.500 0.00±0.01＊＊25.000 0.48±0.03 25.000 0.00±0.01＊＊50.000 0.30±0.04＊＊ 50.000 0.03±0.02＊＊Total flavonoids Isorhammnetin Low－glucose control 0.37±0.04＊＊ Low－glucose control 0.37±0.04＊＊High－glucose control 0.47±0.06 High－glucose control 0.47±0.063.125 0.42±0.05 3.125 0.20±0.04＊＊6.125 0.41±0.05 6.125 0.10±0.03＊＊12.500 0.46±0.06 12.500 0.10±0.03＊＊25.000 0.38±0.02＊ 25.000 0.20±0.08＊＊50.000 0.32±0.06＊＊ 50.000 0.13±0.04＊＊Total ginkgolide Ginkgolide A Low－glucose control 0.37±0.04＊＊ Low－glucose control 0.63±0.07＊＊High－glucose control 0.47±0.06 High－glucose control 0.75±0.153.125 0.44±0.036.125 0.83±0.0312.500 0.43±0.043.125 0.85±0.156.125 0.47±0.0512.500 0.74±0.0225.000 0.42±0.0450.000 0.77±0.07 Total flavonoids hydrolyzate Ginkg 25.000 0.72±0.0250.000 0.41±0.04 olide B Low－glucose control 0.37±0.04＊＊ Low－glucose control 0.63±0.07＊＊High－glucose control 0.47±0.06 High－glucose control 0.75±0.153.125 0.20±0.06＊＊6.125 0.76±0.0712.500 0.20±0.05＊＊3.125 0.75±0.056.125 0.20±0.02＊＊12.500 0.78±0.0925.000 0.10±0.04＊＊50.000 0.70±0.06 Quercetin Ginkg 25.000 0.76±0.0650.000 0.08±0.01＊＊olide C Low－glucose control 0.37±0.04＊＊ Low－glucose control 0.63±0.07＊＊High－glucose control 0.47±0.06 High－glucose control 0.75±0.153.125 0.03±0.03＊＊6.125 0.82±0.1212.500 0.10±0.02＊＊3.125 0.74±0.076.125 0.20±0.04＊＊12.500 0.76±0.1725.000 0.00±0.01＊＊25.000 0.66±0.0450.000 0.06±0.02＊＊ 50.000 0.64±0.10＊

表2 ELISA檢測各組細胞中ColⅣ和FN水平Tab.2 Levels of ColⅣand FN levels in cells in virous groups detected by ELISA （n＝6，）

表2 ELISA檢測各組細胞中ColⅣ和FN水平Tab.2 Levels of ColⅣand FN levels in cells in virous groups detected by ELISA （n＝6，）

＊ P＜0.05，＊＊ P＜0.01compared with high－glucose control group.

FN Low－glucose control 0.94±0.05＊＊ 0.93±0.04 Group ColⅣ＊High－glucose control 0.99±0.02 0.97±0.03 GBE（mg·L－1）0.05 0.97±0.02 0.99±0.030.50 0.97±0.01 0.84±0.08＊＊5.00 0.88±0.04＊＊ 0.92±0.06＊50.00 0.71±0.06＊＊ 0.60±0.06＊＊Ginkgolide A（mg·L－1）0.05 0.96±0.01 0.95±0.040.50 0.99±0.02 0.96±0.045.00 0.99±0.01 0.96±0.0350.00 0.99±0.01 0.95±0.03 Ginkgolide B（mg·L－1）0.05 0.98±0.01 0.95±0.040.50 0.99±0.01 0.95±0.035.00 0.95±0.04 0.97±0.0150.00 0.97±0.04 0.91±0.02 Ginkgolide C（mg·L－1）0.05 0.98±0.03 0.98±0.020.50 0.98±0.02 0.95±0.035.00 0.99±0.02 0.98±0.0450.00 0.97±0.01 0.91±0.03＊＊Total flavonoids（mg·L－1）0.05 0.71±0.09 0.24±0.050.50 0.67±0.06＊ 0.24±0.055.00 0.64±0.07＊ 0.25±0.0350.00 0.62±0.08＊＊ 0.18±0.04＊＊Total ginkgolide（mg·L－1）0.05 0.76±0.08 0.26±0.050.50 0.75±0.04 0.29±0.075.00 0.72±0.06 0.29±0.1150.00 0.61±0.11＊＊ 0.17±0.04＊

DN發病機制復雜，腎組織氧化應激作用增強及抗氧化能力降低在其發生發展中起重要作用［10］。而GBE可減輕糖尿病大鼠體內的氧化應激水平，能預防糖尿病并發癥的發生發展［11］。任明等［12］研究發現：GBE改善糖尿病大鼠體內的氧化應激狀況，可能與其具備抗氧化活性，降低糖尿病大鼠體內的丙二醛 （MDA）和超氧陰離子 （O2－）水平并減弱蛋白激酶C（PKC）的表達有關。本研究結果顯示：對于抑制細胞增殖和ECM積聚方面，GBE中總黃酮起主要作用，本文作者推測與銀杏黃酮的抗氧化應激藥理作用有關。本研究結果表明：對于黃酮成分，黃酮苷元成分活性明顯強于黃酮糖苷。大量研究［13］顯示：黃酮苷元清除人體氧自由基的生物活性明顯優于黃酮糖苷。

本研究結果中銀杏葉總內脂無論是從抑制細胞增殖角度還是ECM積聚角度方面均無明顯效果，僅內脂C在50.000mg·L－1時對細胞增殖有抑制作用。當然出現這種結果并不意味著銀杏葉內脂針對糖尿病腎病無有效藥理作用，抑制細胞增殖和ECM集聚僅是糖尿病發病的部分機制。銀杏內脂A、B、C均是血小板活化因子 （PAF）的強拮抗劑［14－16］，改善腎臟血流量同樣是糖尿病腎病的一個重要治療手段，因此要全面評價銀杏葉內脂的腎臟保護作用，還需進行動物實驗進一步研究。

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