嚴重燒傷對大鼠海馬神經細胞自噬和神經膠質細胞反應的誘導作用

李 雷，王永杰，陳 浩，秦永剛，周煜博，趙嘉勛，郭 麗

（吉林大學公共衛生學院衛生毒理學教研室，吉林 長春 130021）

燒傷是熱、電、化學和放射等造成損傷的總稱，是醫學界一直關注的研究重點。嚴重燒傷并發多器官功能障礙綜合征的死亡率極高。嚴重燒傷引起機體低灌注造成全身性的缺血缺氧和代謝障礙、炎癥反應和Ca2＋穩態失調等是造成多器官衰竭的重要機制［1－2］。海馬體是人類大腦的重要功能區，與學習記憶等高級功能有密切關聯，對炎癥和缺血低灌注損傷極具易感性，是介導應激反應的主要中樞結構，也是應激作用的主要靶器官［3］。研究［4］表明：血腦屏障早在嚴重燒傷7h后開放，并持續數天。嚴重燒傷后，炎癥反應進一步對大腦造成損害［5］。Li等［6］證實：燒傷后大腦血管內皮、神經元和突觸有不同程度的壞死。自噬是真核細胞的細胞器和蛋白質分子降解的主要細胞路徑［7］，機體受到應激刺激可過度激活自噬的發生，造成細胞死亡和組織功能受損。Zhu等［8］研究發現：利用小鼠構建缺血缺氧模型，在腦缺血8h后大量自噬泡形成，自噬相關蛋白輕鏈3蛋白 （light chain 3 protein，LC3B）高表達。并且在神經退行性病變中過度自噬可引起神經細胞壞死［9］。自噬標志物輕鏈3（light chain 3，LC3）的活性形式LC3B是自噬體膜的特異性組成成分，可指示自噬激活。Beclin 1也是常用做評價自噬激活的指示蛋白［10］。

神經膠質細胞是中樞神經系統的主要細胞類型，具有滋養神經細胞、傳遞信息的作用，在中樞神經系統受到損傷時，能保護和重塑神經元［11］。研究［12］表明：在正常情況下神經膠質細胞標志物神經膠質纖維酸性蛋白 （glial fibrillary acidic protein，GFAP）受星形膠質細胞的動力調節，損傷后增生的GFAP陽性星形膠質細胞能促進星形膠質細胞的有絲分裂，使原始祖細胞分化為成熟的星形膠質細胞，GFAP是神經膠質細胞反應性增生的標志。在中樞神經受到刺激或損傷，神經膠質細胞會反應性增生，代償保護神經元免受應激等帶來的損傷［13］。

目前，關于嚴重燒傷后海馬損傷研究主要集中在神經標志物方面，對燒傷能否引起神經細胞自噬和神經膠質細胞反應未見報道。因此，本實驗通過制備嚴重燒傷大鼠模型，探討大鼠海馬體神經細胞在燒傷刺激后的改變，闡明自噬和神經膠質細胞反應在海馬體神經細胞損傷中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康成年雄性Wistar大鼠20只，體質量 （200±20）g，購于吉林大學實驗動物中心，動物合格證號：SCXK－（吉）2008－0005。隨機分為正常對照組和模型組，每組10只。模型組大鼠用于制備燒傷模型。

1.2 燒傷模型的制備 根據文獻 ［14］報道的方法并略有改進制備嚴重燒傷大鼠模型。按照Mech－Rubner公式：A （cm2）＝ K·W2／3［A，動物體表面積；K＝9.1（大鼠）；W，動物體質量］，計算動物30%總體表面積 （total body surface area，TBSA），并在大鼠背部進行標記。大鼠燒傷前背部剃毛，8%硫化鈉脫毛，清水洗凈晾干，備皮待處理。以0.3mL·100g－1體質量的劑量向腹腔內注射10%水合氯醛溶液麻醉后，將大鼠背部的標記區域浸入 （97±1）℃水中18s，造成30%TBSAⅢ度燙傷，之后立即按4mL·100g－1劑量腹腔注入生理鹽水抗休克，分籠飼養，自由進食、飲水。

1.3 大鼠一般情況觀察 造模后1周內觀察大鼠進食、飲水等情況。

1.4 大鼠海馬體神經細胞病理組織學觀察 造模1周后斷頭取大鼠大腦，固定于10%甲醛固定液中。石蠟包埋，切片，HE染色和尼氏體染色，顯微鏡下觀察大鼠海馬體的病理組織學表現。

1.5 免疫組織化學法檢測大鼠海馬體GFAP、神經元標志物微管相關蛋白2（MAP－2）和LC3B、Beclin 1的表達 采用SP法：石蠟切片常規脫蠟，自來水洗3次；98℃枸櫞酸溶液抗原修復5min；室溫冷卻；內源性過氧化物酶阻斷劑室溫孵育30min；PBS洗3次；動物非免疫血清，室溫封閉30min；加一抗 （GFAP和MAP－2，1∶300稀釋；LC3B和Beclin 1，1∶200稀釋），4℃過夜；PBS洗3次；生物素標記二抗，室溫孵育30min；PBS洗3次；加入鏈霉素抗生物素蛋白－過氧化物酶，室溫孵育30min；PBS洗3次；DAB顯色；自來水洗2次；蘇木精復染；弱氨水返藍；過梯度酒精和二甲苯，脫水透明；中性樹脂封片。采用Image Pro Plus 6.0軟件分析 GFAP、MAP－2、LC3B和Beclin 1的表達情況，以積分光密度 （IA）值表示蛋白表達量。

1.6 統計學分析 采用SPSS 20.0統計軟件進行數據分析。各組大鼠海馬體神經膠質細胞中GFAP、MAP－2、LC3B和Beclin 1蛋白表達水平以表示，組間均數比較采用t檢驗。以α＝0.05為檢驗水準。

2 結 果

2.1 大鼠的一般情況 正常對照組大鼠進食、飲水正常，活潑、好動；模型組大鼠在燒傷后1周內進食、飲水減少，萎靡少動。

2.2 大鼠海馬體組織病理形態學 大鼠燒傷后1周，HE染色結果：模型組大鼠海馬體神經細胞呈水腫狀態，核固縮；尼氏體染色結果：模型組大鼠神經細胞內尼氏體淡染，排列紊亂。正常對照組大鼠神經細胞中未觀察到組織病理改變。見圖1。

2.3 免疫組織化學法檢測大鼠海馬體神經細胞標志物的表達 模型組大鼠海馬體神經膠質細胞中GFAP呈高表達，MAP－2表達較少。模型組大鼠海馬體神經膠質細胞中GFAP表達明顯高于正常對照組 （P＜0.05）；模型組大鼠海馬體神經膠質細胞中MAP－2的表達明顯低于正常對照組 （P＜0.05）。見圖2和表1。

2.4 免疫組織化學法檢測大鼠海馬體神經膠質細胞中LC3B和Beclin 1的表達 模型組大鼠海馬體神經膠質細胞中LC3B和Beclin 1自噬蛋白均呈高表達。模型組大鼠海馬體神經膠質細胞中LC3B和Beclin 1表達水平明顯高于正常對照組 （P＜0.05）。見圖3和表1。

表1 嚴重燒傷大鼠海馬體神經膠質細胞中GFAP、MAP－2、LC3B和Beclin 1的表達水平Tab.1 Expression levels of GFAP，MAP－2，LC3B，and Beclin 1in neuroglia cells in hippocampus tissue of severe burn rats（）

表1 嚴重燒傷大鼠海馬體神經膠質細胞中GFAP、MAP－2、LC3B和Beclin 1的表達水平Tab.1 Expression levels of GFAP，MAP－2，LC3B，and Beclin 1in neuroglia cells in hippocampus tissue of severe burn rats（）

＊ P＜0.05compared with normal control group.

Group IA GFAP MAP－2 LC3B Beclin 1 Normal control 3756.38±383.09 10405.05±1472.38 686.52±85.56 982.95±65.68 Model 14372.61±1500.86＊ 4417.90±802.66＊ 2710.84±175.98＊ 4951.59±1062.94＊

3 討 論

本研究結果顯示：模型組大鼠燒傷后1周，狀態較差；HE和尼氏體染色病理觀察顯示：模型組大鼠的海馬神經細胞受損；神經元標志物MAP－2在模型組大鼠海馬體低表達進一步說明受損的神經細胞包括神經元。神經膠質細胞標志物GFAP在海馬體高表達提示：燒傷后海馬體的神經膠質細胞活化，出現反應性增生的現象。同時，模型組大鼠海馬體神經細胞中LC3B和Beclin 1表達明顯升高提示：燒傷后海馬體的神經細胞出現過度自噬。

有研究［15］表明：缺血、缺氧和炎性介質等可造成海馬部位神經元損傷。嚴重燒傷易造成臟器缺血缺氧、細胞中鈣超載、能量代謝障礙、機體炎癥反應和釋放氧自由基及炎癥因子等。在血腦屏障開放的情況下，氧自由基和炎癥因子等進入中樞神經系統，可造成海馬體神經細胞損傷［4］。自噬標志性蛋白LC3B和Beclin 1在模型組大鼠海馬體中呈高表達，表明燒傷啟動了神經細胞的過度自噬過程可能是神經細胞損傷的機制。研究［16－17］表明：創傷性腦損傷 （TBI）中，谷氨酸轉運體GLT－1活性明顯下降，細胞外谷氨酸濃度升高，從而產生神經毒性，可能導致神經元自噬的發生。GLT－1活性下調可導致細胞外谷氨酸濃度升高，刺激NMDA受體、代謝型谷氨酸受體1（mGluRl）和紅藻氨酸鹽受體，導致了神經元自噬發生及興奮性神經元死亡［18］。由此推測嚴重燒傷可能降低了大鼠海馬GLT－1轉運體活性，引起海馬過度自噬的激活。

另外，GFAP作為神經膠質細胞的標志物，在模型組大鼠的海馬體中呈高表達，可能是神經膠質細胞對神經元的代償性保護。研究［13，19－21］顯示：腦缺血后星形膠質細胞反應性上調縫隙連接蛋白Cx43和Cx43mRNA的表達，保護受損的神經細胞。

綜上所述，燒傷作為損傷因素在損傷模型中起主要作用，最終引起神經細胞死亡。嚴重燒傷可誘發中樞神經系統海馬體的神經細胞的過度自噬，損傷神經細胞，受損神經細胞可啟動神經膠質細胞反應性增生以減輕損傷強度，但具體機制及兩者關系仍需深入研究。

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